Valutazione di espressione GFP e sostenibilità Utilizzando la Image-Based Tali Citometro

Questo video illustra una procedura per determinare la vitalità cellulare in cellule esprimenti GFP utilizzando il citometro basato su immagini Tally. Le cellule trasdotte con GFP vengono colorate utilizzando il kit per la vitalità Tally Dead Cell Red, che colora di rosso tutte le cellule morte con ioduro di propidio; le cellule vengono quindi pipettate su un'unità di analisi cellulare Tally e inserite nel citometro, il quale acquisisce e analizza immagini in campo chiaro e in fluorescenza rossa e verde. Vengono quindi generati istogrammi per visualizzare il numero di cellule, la dimensione cellulare, l'intensità di fluorescenza di PI e l'intensità di fluorescenza di GFP, in confronto alla tradizionale citometria a flusso.

Tali può fornire dati simili riguardo alla vitalità cellulare e all'espressione. Tuttavia, questa citometria basata su immagini fornisce informazioni visive aggiuntive sulla popolazione cellulare in esame. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la citometria a flusso o la microscopia a fluorescenza è che il citometro Tali basato su immagini offre simultaneamente informazioni quantitative e informazioni visive sul campione cellulare.

Inoltre, lo strumento di conteggio è più facile da usare, meno costoso e occupa meno spazio rispetto a un citometro a flusso o a un microscopio a fluorescenza. Ciò consente ai ricercatori di eseguire rapidamente saggi quantitativi, come la valutazione della vitalità, in cellule che esprimono GFP direttamente sul bancone del laboratorio. In questa procedura, cellule U2 OS a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro sono state trasdotte con un costrutto virale GFP CellLight mirato al nucleo per evidenziare le cellule morte con ioduro di propidio; trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare in un nuovo tubo da microcentrifuga.

Si raccomanda una concentrazione compresa tra uno per dieci alla quinta e uno per dieci alla settima cellule per millilitro per il saggio, anche se la concentrazione non deve essere esatta. Successivamente, aggiungere un microlitro del reagente Tally Dead Cell Red. Quindi vortexare brevemente per omogeneizzare, incubare la miscela di reagente colorante e cellule a temperatura ambiente al buio per uno a cinque minuti.

Dopo l'incubazione, procedere immediatamente all'analisi sul citometro basato su immagini tally. Il tally utilizza slide di plastica monouso progettate appositamente per lo strumento. Assicurarsi sempre di tenere la slide dai bordi durante il caricamento.

Introdurre delicatamente 25 microlitri di campione in una delle aree a forma di mezzaluna per il caricamento del campione. Qui, le cellule di controllo non trasdotte non colorate vengono caricate nella camera A e le cellule colorate esprimenti GFP vengono caricate nella camera B. Per eseguire un saggio di vitalità in cellule esprimenti GFP, toccare G-F-P-R-F-P sulla schermata principale del citometro. Le opzioni del saggio appariranno quindi a destra: selezionare GFP più vitalità.

Lo strumento chiederà quindi se la serie di campioni deve essere denominata per assegnare un nome alla serie di campioni. Premere ora denominare. Quindi, utilizzando lo schermo tattile, digitare il nome della serie di campioni e premere salva; il citometro di conteggio avanzerà automaticamente alla schermata di misurazione.

Successivamente, per misurare la fluorescenza di fondo, premere la scheda "background" nella metà inferiore destra della schermata di misura, come mostrato qui. L'impostazione predefinita indica che verranno acquisite immagini di nove campi di cellule. Ora, con il campione di controllo rivolto lontano dall'apparecchio, inserire il vetrino nel vano di caricamento fino a quando non si arresta.

Non applicare forza sullo schermo tattile di sfondo per inserire un nuovo controllo di cellule non colorate. Il vetrino verrà automaticamente inserito nell'apparecchio e un'immagine in tempo reale delle cellule verrà visualizzata sullo schermo. Utilizzando la manopola di messa a fuoco, portare le cellule nel corretto piano di osservazione mentre si effettua la messa a fuoco.

Posizionare il pulsante di zoom rosso su 4x o 16x. Per visualizzare meglio la popolazione cellulare, le cellule devono apparire uniformemente scure con un alone luminoso attorno a ciascuna. Come mostrato qui, le cellule possono essere sottostimate quando il passaggio tra lo sfondo e i bordi delle cellule è sfocato, rendendo i confini cellulari non ben definiti.

Le cellule possono essere sovrastimate quando presentano centri luminosi e perimetri scuri. Una volta che le cellule sono state messe a fuoco, toccare e premere per eseguire il controllo delle cellule non colorate. Per misurare la fluorescenza di fondo, il citometro acquisirà automaticamente le immagini e mostrerà miniature di ogni campo visivo.

La barra di avanzamento fornisce un aggiornamento continuo dell'analisi. Al termine dell'acquisizione delle immagini, il citometro espelle automaticamente il vetrino e fornisce i dati derivati dall'analisi delle immagini acquisite. I dati memorizzati vengono visualizzati nel menu a discesa della scheda di sfondo.

Il campione di controllo di fondo riceverà lo stesso nome assegnato all'esperimento. Per eseguire l'analisi del campione transdotto con GFP e colorato con ioduro di propidio, rimuovere la slide dall'apparecchio, girarla e reinserirla con il campione transdotto rivolto lontano dall'apparecchio. Premere la scheda del campione, quindi toccare premere per inserire un nuovo campione.

Quando l'immagine appare sullo schermo, utilizzare la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le cellule. Come in precedenza, toccare quindi premere per eseguire il campione. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, i dati dell'analisi vengono visualizzati nella scheda del campione e il citometro espelle automaticamente il vetrino in modo appropriato.

Smaltire il vetrino per l'analisi cellulare. Poiché si tratta di rifiuti biologici pericolosi, questi vetrini non possono essere riutilizzati. Una volta eseguito il campione, è possibile applicare delle soglie al campione.

Per analizzare popolazioni cellulari specifiche, qui regoleremo le soglie per determinare la percentuale di cellule vive e morte. Nelle cellule che esprimono GFP sotto la scheda del campione, vengono mostrati il numero e la percentuale di cellule che esprimono GFP, le cellule morte che esprimono GFP, la vitalità totale, la dimensione cellulare media, il numero di cellule contate e la concentrazione cellulare.

Inoltre, in fondo allo schermo vengono visualizzati istogrammi che mostrano la dimensione cellulare, la fluorescenza verde e la fluorescenza rossa. Per impostare la finestra della dimensione cellulare, toccare l'anteprima della dimensione cellulare per aprire l'istogramma della dimensione cellulare ed escludere eventuali detriti. Spostare le barre cursore blu per escludere eventi sia grandi che piccoli.

Toccare per applicare e includere le cellule all'interno dei gate. Per aggiungere la fluorescenza GFP all'analisi, toccare l'anteprima dell'istogramma GFP. Per aprirlo.

Spostare la barra del cursore blu per impostare la soglia appena a destra del picco più debole. Utilizzare il campione di controllo come riferimento. Questo consente all'analisi di includere le cellule positive per GFP, escludendo al contempo le cellule autofluorescenti.

L'autofluorescenza viene spesso osservata quando le molecole biologiche all'interno delle cellule sono eccitate. Toccare per confermare e tornare alla schermata precedente. I dati visualizzati nella scheda del campione ora dovrebbero riflettere le porte e la soglia impostate per entrambi i canali di fluorescenza. Successivamente, per separare le cellule colorate con PI dall'autofluorescenza o da qualsiasi fondo presente nel campione, premere la miniatura dell'istogramma di PI per aprirla nuovamente.

Il picco del campione di controllo verrà visualizzato come un picco grigio sull'istogramma. Il picco rosso rappresenta la fluorescenza del campione. La fluorescenza di fondo è visualizzata come il picco più vicino al valore zero di RFU su questo strumento.

Per eliminare la fluorescenza di fondo nel canale PI, spostare la barra cursore blu per regolare la soglia. Per escludere questo picco, utilizzare il picco grigio del campione di controllo come riferimento. Una volta impostata correttamente la soglia nel canale PI, toccare applica per confermare e tornare alla schermata precedente; lo strumento di conteggio analizzerà nuovamente automaticamente i dati e aggiornerà i risultati nella scheda del campione.

Successivamente, per confermare visivamente che ogni cellula sia stata correttamente assegnata, premere la scheda zoom, quindi selezionare un campo visivo acquisito per la revisione premendo la miniatura dell'immagine. Quindi premere la scheda livelli. Successivamente, premere il pulsante GFP o PI per visualizzare l'immagine acquisita attraverso quel canale.

Premere nuovamente lo stesso pulsante per rimuovere il livello dalla visualizzazione o per sovrapporre i livelli; toccare i pulsanti corrispondenti a ciascun canale per identificare in che modo le cellule vengono conteggiate attraverso un canale specifico. Toccare i cerchi intorno alle cellule conteggiate esclusivamente tramite il canale in campo chiaro: quelle che non esprimono fluorescenza verranno cerchiate in blu. Ciò indica che una particolare cellula è una cellula vitale che esprime fluorescenza nel canale verde.

GFP verrà cerchiato in verde nelle cellule che esprimono nel canale rosso. Le cellule colorate con pi verranno cerchiate in rosso e sono le cellule morte conteggiate in entrambi i canali. Il canale rosso e verde verrà cerchiato in giallo.

Ciò indica che la cellula esprime GFP ma è anche colorata con pi e quindi è morta. A volte apparirà sullo schermo un cerchio nero. Si tratta di oggetti che sono stati identificati ma esclusi dall'analisi in base alle dimensioni cellulari.

Continuare a regolare finemente la soglia sull'istogramma della fluorescenza seguendo i passaggi appena descritti, fino a quando ogni cellula che esprime fluorescenza viene circondata con il colore appropriato. Tutti i parametri di analisi vengono salvati automaticamente nello strumento. Sotto la scheda dei dati.

Il dispositivo può archiviare file di dati provenienti da 500 esecuzioni di campioni. Ogni file memorizzato nella scheda dati è disponibile per una nuova analisi. Selezionando il file dalla scheda dati, questo verrà riaperto e tutti gli istogrammi e i livelli diventeranno attivi per archiviare i dati e generare report.

I dati memorizzati nello strumento possono essere trasferiti su un computer utilizzando una chiavetta USB. Quattro tipi cellulari rappresentativi sono stati transdotti con un costrutto virale GFP con localizzazione nucleare, colorati con il kit di vitalità Tally utilizzando il reagente Dead Cell Red ed analizzati mediante il sistema Tally in un citometro a flusso come mostrato qui. Entrambi i metodi hanno riportato approssimativamente la stessa percentuale di popolazione per ciascun tipo cellulare che esprimeva GFP, insieme alla percentuale della popolazione totale che era sia vitale sia esprimente GFP.

Questi dati dimostrano che il citometro Tali è in grado di discriminare tra l'espressione totale di GFP in una popolazione e l'espressione di GFP nella popolazione di cellule vive. Abbiamo appena illustrato come utilizzare il citometro image-based Tali per valutare l'espressione di fluorescenza e la vitalità nel campione cellulare. Questa tecnologia colma il divario tra studi su cellule singole e studi su popolazioni cellulari.

Utilizzando il citometro basato sull'immagine tally, è possibile raccogliere informazioni visive quantitative e qualitative su singole cellule così come su popolazioni cellulari più ampie. Utilizzando la stessa procedura, possono essere eseguiti diversi altri saggi, tra cui apoptosi, espressione di RFP e vitalità cellulare. Per le cellule non esprimenti, le possibili applicazioni includono la valutazione dell'espressione genica fino agli studi sull'efficacia dei farmaci.