Preparazione del campione di
3 settembre 2012
Il profilo metabolico di Mycobacterium tuberculosis È determinata dopo la crescita in colture in brodo. Le condizioni possono essere variate per testare gli effetti di integratori alimentari, ossidanti e anti-tubercolosi agenti sul profilo metabolico di questo microrganismo. Procedura per la preparazione estratto è applicabile sia per 1D 1 H e 2D 1 H- 13 C NMR.
Lo scopo di questa procedura è analizzare, mediante metabolomica NMR, estratti acellulari di mycobacterium tuberculosis provenienti dalla prima coltura, raccogliendo le cellule in un adeguato stadio di crescita. Successivamente, lisare le cellule ed ottenere estratti acellulari per l'analisi. Ri-sospendere gli estratti liofilizzati in tampone per l'analisi NMR.
Infine, raccogliere i dati NMR e analizzare gli spettri mediante software per identificare i metaboliti. In definitiva, l'analisi NMR di Mycobacterium tuberculosis viene utilizzata per mostrare il mantenimento dei livelli di metaboliti dopo diversi trattamenti. La metabolomica NMR può essere applicata ad aspetti fondamentali della fisiologia di Mycobacterium tuberculosis, come i principali percorsi metabolici.
Questa comprensione è fondamentale per chiarire i meccanismi d'azione e di resistenza dei farmaci e per identificare nuovi bersagli per la progettazione di farmaci. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa dell'incapacità di trattare tutti i campioni in modo identico, il che introdurrebbe variazioni inutili e risultati dal mio laboratorio. Lo studente dottorando Steven Luka PhD mostrerà le procedure per il trattamento dei campioni destinati all'analisi NMR. Dal mio laboratorio, la responsabile del laboratorio di ricerca e Robert Fenton, tecnico di ricerca tre, illustreranno ora le procedure per la gestione delle colture di mycobacterium tuberculosis durante la conduzione di M tuberculosis.
La ricerca ha seguito le pratiche del livello di biosicurezza tre definite dalle linee guida istituzionali. Sebbene le etichette in questo video indichino microbacterium tuberculosis per considerazioni di biosicurezza, questa dimostrazione ha utilizzato il micobatterio non patogeno mycobacterium magmatic. Iniziare scongelando una provetta con stock al 50% di glicerolo di M tuberculosis su ghiaccio.
Inoculare 0,15 millilitri in 110 millilitri di brodo M-A-D-C-T-W nella fiala ER da 250 millilitri e coltivare le colture a 37 gradi Celsius con agitazione a 100 giri al minuto per circa sei giorni. Se non sono necessari antibiotici, aggiunte alternative o altri trattamenti, raccogliere le colture destinate a colture che richiedono trattamenti.
Reservare 0,5 millilitri di Eloqua sul ghiaccio per coltura, titolazione e controllo qualità. Quindi eseguire il trattamento desiderato e riposizionare le colture nel termoagitatore al termine del periodo di trattamento. Prelevare un millilitro e determinare l'OD 600.
Inoltre, riservare un campione di 0,5 millilitri per coltura, titolazione e controllo di qualità. Mantenere le cellule sul ghiaccio per tutta la durata del protocollo rimanente. Raccogliere le cellule in quattro provette da 50 millilitri mediante centrifugazione dopo averle lavate con 15 millilitri di acqua doppio distillata fredda di ghiaccio.
Reese sospende i pellet in aliquote da 10 millilitri. Prelevare due aliquote e centrifugare per ottenere il pellet, quindi risospendere il pellet cellulare in un volume finale di un millilitro di acqua bidistillata. Se si desidera una sospensione monocellulare priva di aggregati, far passare le cellule attraverso un ago da 27 gauge.
Procedere tre volte al trasferimento della sospensione cellulare di un millilitro in un contenitore da due millilitri con tappo a vite contenente la matrice di lisi B. Posizionare l'omogeneizzatore di lisi Fast Prep 24 all'interno della cappa biologica. Inserire i campioni nel portacampioni fissando la piastra di ritenzione. Quindi processare per 60 secondi a una velocità impostata di sei metri al secondo.
Successivamente, centrifugare i campioni per formare un pellet di detriti cellulari e cellule integre. Quindi, far passare il sopranatante attraverso un filtro da siringa da 0,2 micron in un tubo sterile per garantire l'assenza di cellule vitali. Piastrare 0,1 millilitro di campione su MADC.Agar.
Congelare i campioni in un bagno di etanolo e ghiaccio secco e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino al momento della liofilizzazione ed elaborazione in una struttura NMR. Dopo due mesi, verificare le piastre per accertare l'assenza di unità formanti colonie. Se non vengono rilevate UFC, i campioni possono essere rimossi dal laboratorio BSL tre per ulteriori analisi in una normale struttura NMR.
Dopo aver asciugato i campioni, risospendere in 0,7 millilitri di tampone NMR e trasferire in una provetta da microcentrifuga; centrifugare per tre minuti a 13.000 ×g. Rimuovere 0,6 millilitri e trasferire in una provetta NMR da cinque millimetri. Per l'analisi dei mezzi, un supporto personalizzato facilita il caricamento di più provette NMR negli spinners alla profondità corretta.
Quindi trasferire i campioni nello spettrometro NMR per inserirli nello changer di campioni A-B-A-C-S da 20 posizioni. Alternare tra colture non trattate e colture trattate con il farmaco. Il primo campione deve essere precaricato nel magnete all'inizio di un'analisi automatizzata.
Per calibrare lo strumento, ottimizzare la durata dell'impulso a 90 gradi con un singolo campione e regolare lo strumento per i campioni rimanenti. Utilizzare l'icona NMR e grad shim. Automatizzare il bloccaggio, la shimatura e la raccolta dei dati NMR per ogni campione.
Per uno spettro NMR 1D di idrogeno, selezionare la sequenza d'impulsi con soppressione dell'acqua e modellatura dell'eccitazione. Impostare un totale di 32.000 punti dati, 128 scansioni e 16 scansioni fittizie per uno spettro due DH uno C 13 hs QC. Selezionare la sequenza d'impulsi.
Selezionare un totale di 2048 punti dati con larghezza di sweep lungo la dimensione diretta H monodimensionale e 64 punti dati con larghezza di sweep lungo la dimensione indiretta C 13. Specificare inoltre la raccolta dello spettro con 128 scansioni e 16 scansioni fittizie per ottenere un buon rapporto segnale-rumore. Uno spettro di m tuberculosis ha generato circa 400 picchi, inclusi 50 metaboliti noti.
Ad esempio, l'elaborazione dei dati descritta nel manoscritto allegato ha prodotto questo spettro di metaboliti direttamente o indirettamente associati al percorso del D-alanina. L'entità delle intensità dei picchi è proporzionale alle concentrazioni dei metaboliti presenti nell'estratto cellulare, pertanto è possibile quantificare le perturbazioni relative nei metaboliti e nei percorsi metabolici tra campioni e trattamenti. La metabolomica LMR apre la strada a ricerche nel campo della batteriologia per esplorare la fisiologia e la patogenesi in micobatteri e altri microorganismi patogeni o non patogeni.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare diversi estratti cellulari di tubercolosi per la metabolomica NMR e, cosa fondamentale, mantenere la coerenza durante l'intero protocollo per ottenere risultati affidabili.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'analisi del profilo metabolomico di Mycobacterium tuberculosis mediante metabolomica NMR. La procedura prevede la coltivazione dei batteri in colture in brodo e la preparazione di estratti privi di cellule per l'analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Metabolomica
- Microbiologia
- Mycobacterium tuberculosis
Sfondo
- Mycobacterium tuberculosis è un patogeno significativo responsabile della tubercolosi.
- La comprensione del suo profilo metabolico può fornire informazioni sulla sua fisiologia.
- La metabolomica mediante NMR è uno strumento potente per l'analisi dei metaboliti.
- Le variazioni nelle condizioni di crescita possono influenzare i profili metabolici.
Scopo dello studio
- Analizzare il profilo metabolico di Mycobacterium tuberculosis.
- Valutare gli effetti di integratori nutrizionali e trattamenti sul metabolismo.
- Utilizzare l'analisi NMR per identificare i metaboliti in estratti acellulari.
Metodi Utilizzati
- Coltivare Mycobacterium tuberculosis in brodo.
- Raccolta delle cellule in una fase di crescita appropriata.
- Lisi delle cellule per ottenere estratti liberi da cellule.
- Risospensione degli estratti in tampone per l'analisi NMR.
Risultati principali
- L'analisi NMR rivela variazioni nei livelli di metaboliti in seguito a diversi trattamenti.
- Identificazione delle principali vie metaboliche influenzate da diverse condizioni.
- Dimostrata l'applicabilità della metabolomica NMR nello studio di Mycobacterium tuberculosis.
- Forniti spunti conoscitivi sugli aspetti fisiologici del batterio.
Conclusioni
- La metabolomica NMR è efficace per l'analisi di Mycobacterium tuberculosis.
- Le variazioni nelle condizioni di crescita influenzano in modo significativo i profili metabolici.
- Questo approccio può migliorare la comprensione del metabolismo della tubercolosi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Un'analisi metabolomica robusta di estratti di Mycobacterium tuberculosis mediante NMR consente un'indagine ad alta affidabilità dei percorsi metabolici in condizioni di trattamento farmacologico e perturbazione genetica. Questo flusso di lavoro supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nella fase di scoperta, fornendo direttamente indicazioni per l'identificazione e la priorizzazione di composti promettenti nello sviluppo di farmaci antitubercolari. Dati metabolici affidabili e quantitativi migliorano l'affidabilità predittiva e la continuità traslazionale lungo tutta la fase iniziale della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente un confronto quantitativo dei profili metabolici tra ceppi di tipo selvaggio e mutanti in diverse condizioni sperimentali.
- Permette l'identificazione di alterazioni nei percorsi metabolici associati all'azione o ai meccanismi di resistenza dei farmaci.
- Facilita la validazione funzionale delle proteine bersaglio correlando le variazioni di geni o proteine con gli spostamenti dei metaboliti.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica chiarificando gli effetti biologici a valle di interventi candidati.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce una preparazione standardizzata e riproducibile dei campioni per la quantificazione dei metaboliti mediante NMR.
- Genera output quantitativi di alta qualità adatti per lo screening degli effetti dei composti sul metabolismo batterico.
- Consente la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per diverse condizioni sperimentali e librerie di composti.
- Permette una valutazione affidabile delle risposte metaboliche ai candidati farmaci.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i parametri metabolici a vie biologiche rilevanti per la malattia, favorendo l'esplorazione di biomarcatori traslazionali.
- Garantisce continuità dallo stadio iniziale di scoperta degli approfondimenti metabolici alla validazione preclinica degli effetti dei farmaci.
- Permette decisioni di avanzamento modulate in base al rischio, basate su perturbazioni metaboliche quantitative.
- Supporta la riduzione predittiva del rischio nella selezione di candidati nei percorsi di sviluppo di farmaci antitubercolari.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro di metabolomica NMR integra le fasi della scoperta iniziale fino all'identificazione dei composti promettenti e alla ricerca preclinica, supportando la validazione degli obiettivi guidata da ipotesi e studi meccanicistici.
- Biologia della scoperta: Il profilo quantitativo dei metaboliti chiarisce il coinvolgimento delle vie metaboliche e la risposta biologica agli interventi.
- Screening: La preparazione standardizzata dei campioni e l'analisi NMR consentono output dosabili e riproducibili nei saggi.
- Analisi: Spettri ad alta risoluzione e analisi statistica facilitano un confronto robusto degli stati metabolici in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: I dati sui metaboliti forniscono informazioni per l'allineamento di biomarcatori e la rilevanza delle malattie nei modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Il protocollo è adattabile per analisi proteomiche parallele e scalabile in diversi disegni sperimentali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione delle proteine bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro metabolomici standardizzati, riproducibili e scalabili.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e riduce il rischio biologico in fase avanzata nei portafogli di farmaci antitubercolari.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione dei candidati farmacologici mirati a M. tuberculosis, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione a livello di biosicurezza 3 e nell'analisi metabolomica mediante NMR.
- Richiede accesso a strumentazione NMR ad alto campo e a software analitici.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i gruppi di lavoro per minimizzare le variazioni nei campioni.
- È adattabile per l'uso con altri sistemi micobatterici o microbici mediante modifiche al protocollo.
- La coerenza dei campioni e il rispetto delle norme di biosicurezza sono fondamentali per ottenere dati affidabili e utilizzabili.
