Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare l'attività dei linfociti T citotossici confrontando un approccio basato sull'impedenza mediante il sistema EXOGEN con il saggio di rilascio del cromo. Il primo passaggio consiste nell'isolare le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue intero utilizzando fial. Successivamente, le PBMC vengono aggiunte alle pozzette insieme all'antigene peptidico, all'IL ricombinante umana due e alle PBMC irradiate per generare linfociti T CD otto specifici per l'antigene.

I linfociti T CD8 specifici per l'antigene vengono quindi coltivati in co-coltura con cellule tumorali in entrambi i saggi, al fine di indurre la morte delle cellule tumorali. I risultati ottenuti mostrano la percentuale di lisi delle cellule tumorali, utilizzando sia il metodo di impedenza sia il saggio di rilascio del cromo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il saggio di rilascio del cromo, è che il sistema basato sull'impedenza raccoglie dati in tempo reale e richiede un numero minore di cellule, che non necessitano di alcuna etichettatura. Per questo protocollo, il sangue proveniente da donatori sani HLA-A2 positivi fornisce una fonte di PBMC, o cellule mononucleate del sangue periferico, seguendo il protocollo del produttore.

Utilizzare F call PA plus per separare le P BMCs dal sangue. Successivamente, distribuire in piastre a sei pozzetti circa 4 milioni di P BMCs in due millilitri di terreno per pozzetto. Aggiungere a ciascun pozzetto il peptide legante HLAA2 a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro di coltura.

Le cellule a giorni alterni per favorire la stimolazione e l'espansione dei linfociti T. Aggiungere mezzo fresco integrato con IL ricombinante umana due in concentrazione finale di 50 unità per millilitro. Dopo una settimana, preparare una coltura di PBMC autologhi, irradiare le cellule e incubarle per due ore con lo stesso HLA.

Un peptide con due siti di legame a 10 microgrammi per millilitro riattiva la coltura aggiungendo un millilitro di PBM CS autologo irradiato a ciascuna. Continuare ad aggiungere mezzo fresco integrato con IL-2 ogni due giorni; dopo un’altra settimana, riattivare nuovamente le colture nello stesso modo. Dopo ulteriori sei giorni di coltura, le cellule saranno pronte per l’uso.

Preparare la stazione di misurazione dell'impedenza cellulare portandola a equilibrio a 37 gradi Celsius sotto una concentrazione di anidride carbonica al 5% per almeno un'ora. Raccogliere le cellule tumorali umane al 75% di confluenza utilizzando tripsina allo 0,25% e centrifugazione. Contare le cellule tumorali mediante emocitometro e ricostituirle in RPMI.

Mezzo tumorale a una concentrazione di 7.500 cellule per microlitro. Successivamente, il software dell'agente Excel ha configurato la pagina del layout con la disposizione delle pozzette. Configurare la pagina della programmazione per eseguire letture di impedenza ogni cinque minuti per un periodo di 40 ore; per le prime 18 ore, il sistema Xceligent eseguirà letture di impedenza solo sulle cellule tumorali.

Quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo tumorale RPMI per pozzetto. Effettuare una lettura di fondo sugli EPL misurando l'impedenza in assenza di cellule. Dopo aver aggiunto le cellule tumorali, caricare le piastre nella stazione EPL e iniziare a effettuare le letture.

Le cellule tumorali inizieranno immediatamente ad aderire agli EPL. Dopo circa 18 ore di incubazione, le cellule tumorali si saranno attaccate agli EPL e avranno raddoppiato, raggiungendo 15.000 cellule tumorali per pozzetto. A questo punto, raccogliere le cellule T preparate mediante raschiamento delicato e centrifugazione con agitazione.

I linfociti T, ricostituirli in mezzo RPMI con il 10% di FBS e contarli utilizzando un emocitometro. Una volta nota la densità cellulare, preparare una serie di diluizioni a due raddoppi dei linfociti T in modo che, quando 200 microlitri di linfociti T vengono aggiunti alle cellule tumorali, la concentrazione più alta sia di 40 linfociti T per cellula tumorale. L'ultima diluizione della serie deve fornire 1,25 linfociti T per cellula tumorale.

Mettere in pausa la stazione EXOGEN e rimuovere l'EPL utilizzando una pipetta. Rimuovere il mezzo dai pozzetti, quindi aggiungere 200 microlitri di cellule T utilizzando tutte le concentrazioni della serie di diluizioni come controllo negativo. Utilizzare mezzo puro, reinserire l'EPL nella stazione e proseguire il programma al termine del saggio.

Normalizzare i risultati. Seguire sempre le procedure di sicurezza istituzionali relative alle radiazioni quando si lavora con cromo 51 e cellule bersaglio marcate con cromo 51, e utilizzare schermature per ridurre l'esposizione alle radiazioni. Iniziare pulsando le cellule tumorali per due ore a un milione di cellule per millilitro con 10 microlitri per millilitro di cromo 51 fresco.

Successivamente, lavare le cellule tumorali in 10 millilitri di terreno RPMI con FBS al 10%, centrifugare le cellule e risospendere nello stesso terreno a una concentrazione di 1 milione di cellule per millilitro. Quindi, in una piastra da 96 pozzetti con fondo rotondo, aggiungere 100.000 cellule tumorali per pozzetto per calcolare il rilascio spontaneo.

Non aggiungere nulla a sei di queste pozzette, rispetto ad altre sei pozzette. Aggiungere 100 microlitri di Triton X-100 per lisare le cellule e quindi calcolare il rilascio massimo in tutte le pozzette rimanenti. Aggiungere le cellule T alla piastra utilizzando la serie di diluizioni preparata in precedenza.

Ora incubare le piastre per cinque ore e raccogliere campioni di 50 microlitri di sopernatante da ciascuna pozzetta. Caricare i campioni su una piastra luma dopo aver essiccato le piastre nell'incubatrice per tutta la notte a temperatura ambiente. Misurare i CPM mediante un contatore a gamma T-cell e SKBR tre. Le cellule tumorali sono state coltivate su piastre X intelligence e è stato misurato l'indice cellulare, che rappresenta una riflessione dell'impedenza della piastra poiché le cellule T non richiedono l'adesione per proliferare.

Il loro effetto sull'impedenza è stato trascurabile durante una coltura di 40 ore. Le cellule tumorali coltivate da sole hanno mostrato un aumento della misurazione dell'impedenza. Tuttavia, l'aggiunta di cellule T a 18 ore interrompe questa tendenza.

Questo evento richiede una normalizzazione software dopo l'aggiunta delle cellule T ed è ulteriormente analizzato nel successivo esperimento. Quando le cellule SK BR 3 sono state coltivate in co-cultura con diverse concentrazioni di cellule T, le riduzioni dell'impedenza sono risultate chiaramente dipendenti dalla dose di cellule T; i dati sono stati raccolti ogni cinque minuti in tre ripetizioni al momento delle 10 ore. Gli indici cellulari hanno seguito un polinomio del secondo ordine nell'intervallo di concentrazioni di cellule T, indicando che la stazione Exogen monitora in tempo reale la morte mediata dalle cellule T CD8+ nei tumori SK B 3 attraverso una diminuzione dell'indice cellulare, al fine di determinare se le riduzioni dell'impedenza delle cellule SK BR 3 indotte dalle cellule T fossero specifiche per l'antigene.

Le cellule SK KBR tre sono state coltivate in co-coltura con linfociti T specifici per l'antigene influenzale di tipo FLU, positivi per HLA A due, che non riconoscono HER due new. Queste cellule hanno mostrato un'attività lítica significativamente inferiore; per determinare ulteriormente se i linfociti T specifici per HER due new uccidessero in maniera specifica per l'antigene, è stato aggiunto un anticorpo contro il ligando Fas nelle co-colture. L'anticorpo non ha ridotto l'attività lítica dei linfociti T specifici per HER due new P 360 9.

Tuttavia, con linfociti T attivati in modo non specifico mediante microsferette anti-CD3 e CD28, l'anticorpo ha inibito la lisi, consentendo di determinare se l'uccisione avvenisse in maniera dipendente dalla classe I dell'HLA. Sono stati aggiunti ai co-colture o un anticorpo anti-classe I dell'HLA o un anticorpo di controllo isotipico. I risultati hanno fortemente sostenuto questa ipotesi.

I linfociti T sono stati successivamente coltivati in co-coltura con altre cellule tumorali in un rapporto di uno a cinque. La linea cellulare tumorale negativa per HLA A due, BT 20, è stata utilizzata come controllo negativo. I risultati mostrano che il metodo è utile per molteplici cellule tumorali aderenti bersaglio.

I co-colture delle nuove cellule T specifiche per HER2 P360-9 sono state aggiunte a cellule bersaglio marcate con cromo-51, seguite dall'analisi CRA. Il saggio di intelligence risulta più sensibile per analizzare la coerenza. La variazione intra-saggio è stata calcolata come coefficiente percentuale di variazione ad ogni rapporto cellulare compreso tra 1:40 e 1:5.

Questo valore è risultato inferiore al 15% nei rapporti cellulari più bassi. Tuttavia, la percentuale di CV era elevata o imprevedibile. Inoltre, è stata esaminata la variabilità della lisi delle cellule T SK BR tre indotta dalla co-coltura con diverse linee cellulari T specifiche per P 360 9.

I dati sono stati generati a distanza di 30 giorni. I saggi sono stati eseguiti in triplice replicato e i risultati sono risultati molto simili. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare l'attività dei linfociti T citotossici utilizzando linfociti T CD8 specifici per l'antigene e cellule tumorali, mediante un approccio basato sull'impedenza.