Rilevamento di aspergillosi polmonare in pazienti con neoplasie ematologiche maligne utilizzando la tecnologia a flusso laterale

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'utilizzo di un dispositivo a flusso laterale per la rilevazione rapida dell'antigene diagnostico di aspergillo nei campioni di siero umano e nei liquidi di lavaggio broncoalveolare (BAL). Questo viene realizzato applicando innanzitutto il campione di siero o BAL alla porta di rilascio del dispositivo a flusso laterale. Il secondo passaggio consiste nel permettere alla soluzione di migrare lungo la membrana.

Il passaggio successivo consiste nel determinare se il test è valido esaminando la linea di controllo interna. L'ultimo passaggio consiste nell'interpretare il risultato del test esaminando la linea di test. In definitiva, il dispositivo a flusso laterale viene utilizzato per rilevare la presenza dell'antigene diagnostico di Aspergillus nei fluidi sierici o nel lavaggio broncoalveolare (BAL).

Il test LFD per Aspergillus può essere utilizzato come test complementare per la diagnosi di aspergillosi polmonare invasiva. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunoassay enzimatico per galactomanna di Aspergillus, il test panf, fundal, beta-glucano e il test PCR per Aspergillus è che si tratta di un test diagnostico rapido effettuabile al letto del paziente, che richiede minime strutture di laboratorio e formazione. Sebbene il LFD sia stato sviluppato per il rilevamento di specie di Aspergillus, la tecnologia a flusso laterale può essere applicata anche al rilevamento di altri agenti patogeni infettivi come Cetosporium, Fusarium e specie di Riser.

Incorporando anticorpi monoclonali specifici per questi organismi, la dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale. Poiché l'interpretazione dei risultati del test immunocromatografico richiede familiarità con il formato del saggio, per raccogliere il siero da campioni di sangue non trattati, lasciare coagulare il sangue a quattro gradi Celsius. Il siero e i campioni di lavaggio broncoalveolare, o fluidi BAL, devono essere conservati in aliquote a meno 20 gradi Celsius prima dell'uso; la conservazione in aliquote limita il potenziale degrado dell'antigene bersaglio dovuto al ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni durante test ripetuti. Per preparare i campioni di siero e BAL per l'analisi, scongelare i campioni a temperatura ambiente, quindi mantenerli sul ghiaccio. Mescolare accuratamente mediante vortex e quindi centrifugare per un minuto a 14.000 RPM. Per l'analisi di routine di campioni umani, diluire il siero uno a uno con mezzo per colture cellulari; in alternativa, per dissociare l'antigene bersaglio dai complessi immunitari sierici, diluire il siero uno a due con PBS contenente 4% EDTA, riscaldare per tre minuti in un bagno d'acqua in ebollizione e centrifugare per cinque minuti a 14.000 RPM.

I fluidi BAL umani non richiedono pretrattamenti. Un campione di BAL, dopo essere stato scongelato, agitato in vortex e centrifugato, è un campione limpido che può essere applicato direttamente sul dispositivo a flusso laterale. Per i test, i dispositivi a flusso laterale (LFD) sono conservati a temperatura ambiente o a 23 gradi Celsius, condizioni alle quali rimangono stabili per 12 mesi.

Per iniziare il saggio, rimuovere i dispositivi dalle loro confezioni e posizionarli su una superficie piana. Utilizzando una punta di pipetta sterile, applicare 100 microlitri di siero pretrattato nel porto di rilascio del dispositivo entro pochi secondi. Il liquido dovrebbe migrare per azione capillare lungo la membrana di cellulosa nitrata nella finestra di osservazione.

Nello stesso modo, applicare 100 microlitri di un campione di BAL non diluito alla porta di rilascio del dispositivo. Lasciare procedere il saggio per 15 minuti a temperatura ambiente, momento in cui i risultati del test devono essere registrati. Il test non deve essere lasciato per più di 15 minuti prima della registrazione dei risultati.

Poiché ciò potrebbe influenzare l'interpretazione dei risultati, una reazione settimanale non verrà potenziata prolungando il periodo di incubazione. Il LFD è costituito da una linea di controllo interno indicata dalla lettera C sulla carcassa in plastica e da una linea di test indicata dalla lettera T. La linea di controllo deve sempre apparire, indipendentemente dalla presenza dell'antigene aspergillo nel siero o nel campione di BAL. Ciò indica che il saggio è stato eseguito correttamente se l'antigene aspergillo è presente nel siero o nel campione di BAL.

La linea di test apparirà anche entro 15 minuti dall'applicazione del campione. L'intensità delle reazioni di test per la malattia di Lyme è proporzionale alle concentrazioni dell'antigene bersaglio nei campioni di siero e VAL. L'aspetto più complesso di questa procedura è l'interpretazione dei risultati del test.

I risultati del test immunocromatografico devono essere letti dopo 15 minuti e il risultato del test deve essere confrontato con l'esempio rappresentativo mostrato qui. In questa figura sono mostrati esempi rappresentativi di risultati deboli positivi, moderatamente positivi e fortemente positivi del test immunocromatografico con campioni di lavaggio broncoalveolare e siero. Qualsiasi linea di test positiva nel campione di siero, indipendentemente dall'intensità, indicherebbe aspergillosi polmonare invasiva o malattia IPA a causa della presenza di antigene di Aspergillus in circolo nel torrente ematico. Reazioni positive nel lavaggio broncoalveolare, indipendentemente dall'intensità, indicherebbero germinazione delle spore e sviluppo di ife potenzialmente patogene nei polmoni.

In assenza di antigene aspergillo, non apparirà alcuna linea di test e il risultato viene registrato come negativo. Questa tabella mostra i risultati dei test LFD effettuati utilizzando fluidi BAL provenienti da pazienti affetti da leucemia mieloide acuta o da pazienti con ML, diagnosticati secondo i criteri diagnostici del gruppo di studio dell'Organizzazione Europea per la Ricerca e il Trattamento del Cancro e dell'Istituto Nazionale per le Allergie e le Malattie Infettive. Nella tabella sono inclusi i corrispondenti dati clinici e psicologici, nonché i risultati di un test PCR specifico per ASPERIA per ciascun paziente.

Secondo le linee guida E-O-R-T-C-M-S-G del 2002, i pazienti 12, 13 e 16 sono stati diagnosticati con aspergillosi invasiva possibile sulla base di fattori legati all'ospite e criteri clinici oppure della positività al GM. Secondo le linee guida E-O-R-T-C-M-S-G riviste del 2008, i fattori legati all'ospite e la positività al GM da soli, oppure i fattori legati all'ospite e i criteri clinici da soli, non indicherebbero un'infezione fungina invasiva possibile, a meno che non siano accompagnati da evidenze di supporto provenienti rispettivamente dai dati clinici e dalla micologia. Il paziente sei è stato diagnosticato con aspergillosi invasiva probabile secondo entrambe le linee guida del 2002 e del 2008, a causa di fattori legati all'ospite, caratteristiche cliniche maggiori e minori e positività al GM.

Infine, si noti che, sebbene attualmente né il saggio LFD né il saggio PCR siano inclusi nelle linee guida E-O-R-T-C-M-S-G nei campioni di lavaggio broncoalveolare (BAL) dei pazienti sei e dodici, esiste un forte accordo tra i due saggi e il test commerciale per la gala manin, che indica la presenza di antigene e acido nucleico di aspergillus. Seguendo questa procedura, altri metodi come il saggio enzimatico per la glattomanina (Pella Glactomannan), il test panf, il test per il beta-glucano fungino o i test PCR per aspergillus possono essere eseguiti in parallelo per confermare la malattia fungina invasiva. Non dimenticare che lavorare con siero umano e fluidi di BAL può essere estremamente pericoloso e gli operatori del dispositivo dovrebbero sempre essere vaccinati contro malattie come l'epatite B e la tubercolosi.I.