Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare come rilevare in modo accurato e specifico i metaboliti dell'ossido nitrico in campioni biologici. Questo viene ottenuto processando immediatamente i campioni di sangue dopo il prelievo, per prevenire la perdita di metaboliti o la formazione di artefatti. Contemporaneamente, viene effettuato un prelievo tissutale rapido ed efficiente per minimizzare gli effetti di un ambiente ipossico sui metaboliti dell'ossido nitrico.

Si raccolgono anelli aortici e li si sospende in un bagno d'organo per valutare la loro funzione endoteliale. Inoltre, si utilizzano saggi biochimici per quantificare i livelli di nitrato, i livelli di nitrito e i livelli relativi di nitro tioli e di altri prodotti nitrosati nei tessuti. Mediante questi saggi, un confronto appropriato tra animali sperimentali e di controllo può generare informazioni preziose sulla produzione e sul metabolismo dell'ossido nitrico.

Il principale vantaggio dell'utilizzo di questo approccio multisistemico rispetto a metodi o saggi singoli è che consente una visione più ampia della biochimica dell'ossido nitrico in diversi sistemi organici. In questo modo possiamo iniziare a comprendere quali di questi metaboliti possano avere un'utilità prognostica o diagnostica e in che modo il repertorio dei metaboliti dell'ossido nitrico rifletta la formazione e la disponibilità di ossido nitrico endoteliale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché ogni passaggio del processo è cruciale per mantenere l'integrità del campione.

Alcuni di questi passaggi non sono evidenti dalla lettura della sezione dei metodi in una tipica rivista scientifica, a causa del dettaglio minuzioso relativo alla raccolta del campione ed all'estrazione del tessuto. A dimostrare questa procedura sarà la dottoressa Hong Jing, ricercatrice senior nel mio laboratorio. Per questo protocollo, è necessario avere a disposizione una persona o un animale da esperimento per la raccolta di sangue, e i cui tessuti saranno inoltre esaminati.

Prima di tutto, raccogliere il sangue intero inserendo un ago da 25 gauge nella vena cava inferiore. Una volta raccolti da 500 a 1000 microlitri, perfondere l'animale per rimuovere il sangue residuo infondendo un buffer fisiologico attraverso l'apice del ventricolo sinistro, permettendo così la completa sostituzione del sangue mentre questo e il buffer fuoriescono dalla vena cava inferiore. Il sangue venoso deve essere raccolto immediatamente dopo la prelievo in provette da centrifuga da 1,5 millilitri contenenti NEM ed EDTA.

Centrifugare il sangue a 14.300 RCF per sette minuti. Aspirare il plasma dal pellet di globuli rossi con una pipetta e trasferirlo in un tubo separato. Preparare i campioni di plasma isolato per HPLC aggiungendo prima un volume uguale di metanolo freddo a 50 microlitri della raccolta di plasma.

Agitare vigorosamente la miscela nel vortice per tre-cinque secondi finché non diventa torbida. Quindi centrifugare la miscela a 14.300 RCF per sette minuti. Per precipitare le proteine plasmatiche, raccogliere il soprannatante in un tubo separato da 1,5 millilitri e conservarlo a quattro gradi Celsius fino al momento dell'analisi.

Per preparare il plasma per l'analisi della chemiluminescenza, prendere il volume rimanente di plasma, che dovrebbe essere compreso tra 200 e 400 microlitri, e dividerlo in due aliquote. Preparare una metà del plasma aggiungendo un volume pari al 10% di solfuro acido al 5% e attendere 10 minuti. Questo campione è ora pronto per l'analisi con CLD.

Preparare l'altra metà del plasma aggiungendo, dopo cinque minuti, il 10% in volume di cloruro mercuroso al 2%. A temperatura ambiente, aggiungere il 10% in volume di solfondiamide acidificata. Attendere altri 10 minuti e iniettare questo campione nel CLD come per il plasma.

Il pellet di globuli rossi può essere preparato per HPLC e CLD per entrambe le analisi. Iniziare mescolando una parte di pellet cellulare con quattro parti di soluzione ipotonica di lisi. Vortexare accuratamente la miscela per l'analisi CLD.

La preparazione delle cellule è la stessa effettuata per il plasma. Iniziare aggiungendo un volume uguale di metanolo. Quindi vortexare la miscela energeticamente per tre-cinque secondi, seguito da una centrifugazione per sette minuti a 14.300 RCF.

Ora asportare con la pipetta il soprannatante e conservarlo a quattro gradi Celsius fino all'analisi mediante HPLC per determinare i livelli tissutali dei metaboliti dell'ossido nitrico. Nei tessuti di interesse provenienti da animali sperimentali, il sangue deve essere prima raccolto e preparato come descritto nella sezione precedente; la raccolta dei tessuti deve essere effettuata normalmente, prestando particolare attenzione alla rapidità e all'efficienza, in modo che i tessuti non diventino ipossici. Una volta raccolti, omogeneizzare i campioni tissutali in un rapporto di uno a cinque di PBS contenente N-E-M-E-D-T-A.

Quindi preparare i tessuti omogeneizzati per l'analisi mediante HPLC e CLD come descritto nelle sezioni precedenti per i globuli rossi. Dopo aver anestetizzato un topo adulto con etere etilico e aver verificato che non risponda a una pressione sul dito del piede, eseguire una toracotomia. Effettuare un'incisione mediana dallo sterno fino alla regione pubica per esporre le cavità toracica e addominale.

Successivamente, perfondere l'animale con soluzione tampone Krebs Alite ossigenata. Utilizzare una siringa da 25 gauge per iniettare il tampone nell'apice del ventricolo sinistro. L'atrio destro viene aperto per fornire un'uscita al sangue.

Dopo la perfusione, isolare l'aorta addominale rimuovendo il fegato, i polmoni e altri tessuti che potrebbero coprire l'aorta. Successivamente, tenere il cuore con una pinzetta e staccare delicatamente l'aorta dalla parete posteriore dell'animale. Posizionare il cuore e l'aorta in una piastra di Petri riempita di ghiaccio.

Buffer di Krebs freddo nella piastra. Rimuovere con cura e pulire il grasso e l'avventizia dall'aorta. Evitare di danneggiare l'endotelio all'interno del vaso durante la pulizia.

Mantenere l'aorta a un metabolismo lento per prevenire l'ipossia, trasferendola ogni cinque minuti in un nuovo tampone ghiacciato e ossigenato. Ora utilizzare un bisturi per tagliare l'aorta in segmenti anulari lunghi tre millimetri. Trasferire i segmenti in un bagno d'organo tissutale da 10 millilitri a quattro canali, riempito con tampone di Krebs ossigenato.

Utilizzando la manopola del trasduttore, applicare una pre-tensione di 1,5 grammi a ciascun anello aortico. Secondo evidenze empiriche, 1,5 grammi è la tensione iniziale appropriata per una funzione vasomotrice ottimale.

Nel monitor del topo, registrare la misurazione della forza utilizzando un ponte ottuplo a otto canali e un software di acquisizione dati, lasciare che gli anelli raggiungano l'equilibrio per 80 minuti, cambiando il buffer ogni 20 minuti, quindi procedere con l'esperimento. Una volta che la tensione del tessuto ha raggiunto l'equilibrio, aggiungere 100 nanomolar di fennel rine a ciascun anello per indurre una contrazione submassimale. Quando la tensione degli anelli si è stabilizzata e si osserva un livello costante di tono, eseguire un'analisi della risposta in funzione della dose a un agonista endoteliale come l'acetilcolina.

Questo determinerà la produzione di ossido nitrico e il grado di rilassamento del vaso. Dopo la risposta dose-dipendente all'acetilcolina, risciacquare i bagni con soluzione di Krebs e aggiungere 100 nanomolar di fennel rine in ciascun bagno organotipico per indurre la contrazione dei vasi. Successivamente, valutare nuovamente la risposta degli anelli di muscolo liscio a una fonte esogena di ossido nitrico, come il nitrato di sodio, in presenza e in assenza di ODQ, un inibitore della guanilato ciclasi solubile.

Questo tipo di approccio determinerà un valore di rilassamento pari al 100% per i vasi e dimostra inoltre il ruolo essenziale della guanilato ciclasi solubile nel mediare la risposta dell'ossido nitrico al rilassamento vascolare. Poiché l'ODQ impedisce il rilassamento indotto dal nitroprussiato di sodio in risposta all'acetilcolina, anelli aortici provenienti da topi di controllo sani si rilassano, mentre anelli aortici provenienti da topi con disfunzione endoteliale mostrano un rilassamento ridotto a causa della diminuzione della produzione di ossido nitrico. Sono stati inoltre eseguiti saggi specifici di denitrosilazione sugli animali di controllo mediante chemiluminescenza del nitrito.

RSNO e RNNO sono stati rilevati utilizzando un saggio riduttivo di denitrosilazione. Sottraendo le aree dei picchi, sono stati misurati i livelli di nitrito e r sno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia dell'ossido nitrico e vascolare, ad esempio come i livelli circolanti di questi metaboliti dell'ossido nitrico riflettano i livelli tissutali e come i metaboliti delle malattie cambino in diverse condizioni patologiche?

La determinazione delle concentrazioni allo stato stazionario e della emivita di questi importanti metaboliti dell'ossido nitrico in multipli sistemi organici e in tutta la circolazione di un singolo animale permetterà l'identificazione di specifiche firme molecolari dei processi patologici e ci aiuterà a definire nuove modalità terapeutiche basate sull'ossido nitrico, fornendo al clinico biomarcatori migliori per valutare la gravità o la progressione della malattia. In generale, le persone nuove nel campo dell'acido nitrico incontreranno difficoltà perché molti metodi non sono sufficientemente sensibili per rilevare e quantificare questi bassi livelli di metaboliti dell'acido tricarbossilico presenti nei campioni biologici. Prima di tutto, una tecnica non appropriata potrebbe generare artefatti durante l'elaborazione del campione, portando a dati errati e a un'errata interpretazione dei risultati.