Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano

L'obiettivo generale del seguente esperimento è dimostrare l'utilizzo della tecnologia image stream per quantificare i meccanismi cellulari di cellule immunitarie primarie provenienti da coorti di pazienti ben definite. Questo viene raggiunto isolando innanzitutto le cellule mononucleate del sangue periferico, o pbmc, da campioni di sangue ottenuti da pazienti o da volontari sani. Dopo l'isolamento, le cellule vengono attivate e successivamente marcate con fluorescenza.

Successivamente, le cellule vengono focalizzate idrodinamicamente, eccitate con luce laser e immaginate mediante integrazione temporale ritardata su una telecamera CCD. Infine, le immagini vengono acquisite utilizzando il citometro a flusso con acquisizione di immagini e la quantificazione di NF-kappa B.

La traslocazione in ogni immagine cellulare viene eseguita utilizzando il software ideas. In definitiva, le differenze tra ciascun gruppo sperimentale possono essere determinate attraverso l'analisi di grafici a punti, istogrammi e immagini cellulari. Il vantaggio dell'immagine in flusso è che combina dati e immunofluorescenza.

Siamo in grado di analizzare le vie di segnalazione cellulare in modo specifico per linea cellulare, sia a livello di singola cellula che di popolazione, partendo da un piccolo campione di sangue. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della conoscenza localizzando e quantificando gli intermedi della segnalazione. Ad esempio, può essere utilizzato per studiare la traslocazione nucleare mediata da fattori trasparenti o per esaminare gli effetti dell'invecchiamento sulla biologia cellulare.

Un responsabile del mio laboratorio dimostrerà la tecnica dopo aver isolato le cellule mononucleate del sangue periferico ottenute da volontari umani. Risospendere le PBMC recuperate a una concentrazione di tre volte 10 alla sesta cellule per 0,6 millilitri di mezzo, quindi trasferire la sospensione cellulare in provette da 1,5 millilitro. Successivamente, stimolare alcune delle cellule con un agente attivante, come l'agonista del TLR8, R848, mostrato qui, quindi incubare tutte le cellule a 37 gradi Celsius per 10-60 minuti in un incubatore con 5% di anidride carbonica.

Al termine del periodo di incubazione, centrifugare le cellule per cinque minuti a 500 ×g a temperatura ambiente, eliminare il soprannatante, etichettare le cellule con un cocktail di anticorpi specifici per le linee cellulari dei monociti o delle cellule dendritiche per 20 minuti a quattro gradi Celsius, includendo provette di cellule marcate con coniugati monocromatici da utilizzare come controlli di compensazione. Successivamente, fissare le cellule in PFA al 4% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver centrifugato le cellule per 10 minuti a 500 ×g a temperatura ambiente, risospendere i PBMC nel buffer di congelamento e conservare le cellule a -80 gradi Celsius fino al giorno dell'analisi.

Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius e, dopo averle centrifugate per rimuovere il buffer di congelamento, permeabilizzarle con 100 microlitri di buffer BD Perm Wash. Successivamente, etichettarle con anticorpi diretti contro componenti intracellulari della trasduzione del segnale, come gli anticorpi anti NF kappa BP 65 mostrati in questo caso, per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la formazione del pellet, risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer BD Perm Wash contenente IgG di capra anti coniglio.

Alexa 6 47 e incubare i PBMC per altri 20 minuti a temperatura ambiente. Immediatamente prima dell'acquisizione delle immagini, controcolorare le cellule con un colorante nucleare; iniziare accendendo l'Image Stream e quindi avviando il software Inspire. Successivamente, fare clic su Carica modello predefinito e quindi selezionare Inizializza fluidica.

Quindi fare clic sul menu della galleria di immagini e selezionare tutto. Ora premere "esegui configurazione" per iniziare l'acquisizione delle immagini delle perle, quindi selezionare il canale in campo chiaro. Una volta che le perle di velocità sono in esecuzione, fare clic su "inizia tutto" nella scheda assist per calibrare e testare lo strumento.

Dopo aver calibrato il sistema ImageStream, premere flush, lock e load per caricare il campione più luminoso nell'apparecchiatura. Quindi impostare la potenza del laser in modo che ogni fluorocromo presenti un valore massimo del pixel compreso tra 104.000 conteggi, come misurato nei diagrammi a dispersione. Successivamente, impostare i criteri di classificazione delle cellule.

Ora fare clic su Esegui, Acquisisci per raccogliere e salvare il file di dati dell'esperimento. Per analizzare i file di dati, aprire innanzitutto IDEAS. Il software analitico crea file di immagini compensate, quindi applica un gate sugli eventi con un'intensità normale del colorante nucleare e un elevato rapporto di aspetto del colorante nucleare. Per distinguere le singole cellule nel gate R1 dai detriti o dagli eventi multicellulari, i monociti si trovano all'interno del gate per le cellule positive a CD14; le cellule dendritiche mieloidi, che esprimono livelli elevati di CD11c e bassi livelli di CD4 e dei marcatori lin1, sono nel gate R3.

Infine, utilizzare il software IDEAS per determinare la codistribuzione del fattore di trascrizione citoplasmatico NF-kappa B con il colorante nucleare. Un'elevata correlazione tra NF-kappa B e il colorante nucleare, indicativa di codistribuzione dei due marcatori, si riflette in un punteggio di somiglianza elevato e indica il grado di attivazione della cellula. La percentuale di eventi con elevata somiglianza tra diversi gruppi trattati o popolazioni di pazienti può essere confrontata per valutare l'efficienza funzionale relativa delle cellule secondo l'approccio IDEAS.

Il software può quindi essere utilizzato per visualizzare immagini di cellule provenienti da segmenti chiave di istogrammi di popolazione. ImageStream consente il gating di sottopopolazioni cellulari direttamente dai pbmc e l'acquisizione di immagini delle risposte cellulari a partire da popolazioni cellulari gated, ma non ordinate. Qui l'effetto della segnalazione TLR sulla localizzazione nucleare di NF kappa BP 65 in lin uno, negativi per CD quattro, CD undici C positivi dim di cellule dendritiche mieloidi è stato quantificato alla baseline.

È stata osservata una percentuale elevata di cellule non stimolate con il fattore di trascrizione NF kappa B p65 nel citoplasma. Dopo la stimolazione, si è determinato che le cellule trattate presentavano un punteggio di similarità significativamente più alto tra NF kappa B p65 e la colorazione nucleare con PI, indicando che NF kappa B p65 si era traslocato nel nucleo dopo la stimolazione. Le immagini digitali acquisite contemporaneamente dalle popolazioni cellulari non trattate o stimolate con R848 mostrano cellule rappresentative e l'intensità della traslocazione di NF kappa B nel nucleo cellulare. Si noti l'intensità maggiore della colorazione di NF kappa B e di PI nel gruppo stimolato con R848 rispetto alle cellule non trattate.

Abbiamo utilizzato questa tecnica su cellule provenienti da donatori di diverse età e abbiamo evidenziato differenze nei percorsi di attivazione di NF-kappa B mediati da TLR. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro un giorno, con tempo aggiuntivo dedicato all'analisi delle immagini, consentendo di ottenere sia immagini di localizzazione che statistiche di popolazione. Inoltre, possiamo acquisire direttamente le risposte di più popolazioni cellulari senza separazione fisica. L'analisi mediante image stream può essere ampiamente applicata a numerosi meccanismi cellulari e risulterà molto utile nella ricerca traslazionale.