TransFLP - un metodo per modificare geneticamente

Lo scopo di questa procedura è quello di manipolare geneticamente il vio cray utilizzando un metodo rapido e carente, basato sulla trasformazione naturale e sulla combinazione flip. Questo viene realizzato innanzitutto preparando un'adeguata fonte di chitina, poiché la chitina è l'induttore naturale della trasformazione. Nella seconda fase, viene generato un costrutto di DNA mediante due cicli di PCR e viene effettuata la loro trasformazione naturale, consentendo ai batteri plasmidici PBR flip di incorporare il frammento PCR nei loro genomi.

Successivamente, un aumento della temperatura induce l'enzima lipasi codificato dal plasmide per rimuovere la cassetta di resistenza agli antibiotici delimitata dal sito di ricombinazione flip (FRT). Nell'ultima fase, i batteri vengono eliminati del plasmide che codifica per FLP. Infine, PCR e sequenziamento vengono utilizzati per dimostrare che la manipolazione genetica è stata eseguita con successo.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di plasmidi suicidi per manipolare geneticamente i vire, è che questo metodo è molto rapido ed efficiente. Iniziare pesando campioni di 50-80 milligrammi di scaglie di chitina in provette di plastica standard da 1,5 millilitro, quindi, mantenendo i coperchi delle provette aperti, sterilizzare le scaglie in autoclave; una volta terminato il ciclo di sterilizzazione, chiudere immediatamente i coperchi e conservare le scaglie trattate in autoclave a temperatura ambiente. Sono richiesti almeno sei oligonucleotidi per amplificare mediante PCR le regioni di DNA di interesse, nonché la cassetta antibiotica delimitata da sequenze FRT. Si raccomanda inoltre di includere una coppia di primer oligonucleotidici esterni al frammento PCR inserito.

Questo permette di verificare l'integrazione e l'escissione corretta della cassetta di resistenza agli antibiotici delimitata da FRT, progettata, e i numeri due, tre, quattro e cinque, oligonucleotidi con attenzione. I primer due e cinque devono contenere almeno 28 paia di basi per potersi appaiare in modo sufficiente al DNA genomico e ai primer. I primer tre e quattro devono essere costruiti utilizzando un plasmide contenente FRT come modello; progettare i primer due e cinque in modo da consentire un appaiamento esteso di basi complementari all'estremità 5' rispettivamente tra i primer due e tre e tra i primer quattro e cinque.

Ora, per il primo ciclo di PCR, utilizzare gli oligonucleotidi uno e due per preparare la prima di tre reazioni di PCR simultanee ma indipendenti, finalizzate all'amplificazione della regione upstream della regione sperimentale di interesse nei costrutti progettati su misura. In parallelo, preparare la seconda reazione di PCR utilizzando gli oligonucleotidi tre e quattro per amplificare la cassetta antibiotica delimitata da sequenze FRT. Ad esempio, in questo esperimento, è stato utilizzato il gene A PH che codifica per la resistenza alla canicina.

Amplificare contemporaneamente la regione di DNA a valle preparando la terza reazione di PCR utilizzando gli oligonucleotidi cinque e sei e il DNA genomico come stampo. Successivamente, dopo la purificazione di tutti e tre i frammenti di PCR, avviare la reazione di PCR per tutti e tre i campioni, utilizzando una miscela contenente quantità equimolari di tutti e tre i frammenti ottenuti nel primo ciclo come stampo per eseguire un secondo ciclo di PCR. Questa amplificazione sarà catalizzata dagli oligonucleotidi uno e sei.

Il frammento PCR risultante fungerà da DNA trasformante negli esperimenti di trasformazione naturale. Dopo aver coltivato le cellule di V. cholerae, utilizzare un mezzo arricchito in condizioni aerobiche a 30 gradi Celsius. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione a temperatura ambiente.

Successivamente, trasferire la coltura batterica sul kite sotto forma di fiocchi e incubare la sospensione cellulare tutta la notte a 30 gradi Celsius. Poi, mescolare accuratamente almeno 200 nanogrammi di frammenti ottenuti dalla seconda serie di PCR nella sospensione di cellule batteriche. Avendo cura di non staccare eccessivamente i batteri dalle superfici di chitina, incubare quindi questa soluzione a 30 gradi Celsius senza movimento per un altro giorno.

Ora vortexare vigorosamente la coltura per almeno 30 secondi; distribuire da 100 a 300 microlitri della soluzione cellulare su piastre doppio selettive contenenti ampicillina, oltre all'altro antibiotico presente nelle piastre. Incubare le colture batteriche a 30 gradi Celsius fino a quando le colonie diventano visibili. Successivamente, isolare i singoli trasformanti dalle piastre selettive.

Iniziare questo passaggio coltivando i batteri su piastre di agar LB contenenti ampicillina a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Come passaggio opzionale, modificare la temperatura per due-tre ore portandola a 40 gradi Celsius, poiché l'espressione di flip dal plasmide PBR flip viene de-repressa a temperature più elevate. Dopo ulteriori otto ore di incubazione a 37 gradi Celsius, trasferire i batteri su piastre fresche.

Ora selezionare in parallelo le colonie su piastre di agar contenenti antibiotico e su piastre senza antibiotico per verificare la sensibilità agli antibiotici, quindi isolare una singola colonia risultante sensibile all'antibiotico. Iniziare questo passaggio coltivando la coltura per tutta la notte in condizioni aerobiche a 30 gradi Celsius, in un mezzo arricchito senza antibiotici. La mattina successiva, coltivare una nuova coltura per tre-sei ore diluendo la coltura notturna in rapporto di uno a 100 in un mezzo fresco privo di antibiotici; nel pomeriggio effettuare lo streak o la diluizione su piastre di agar LB semplici e quindi incubare le piastre per altre otto-sedici ore a 30 gradi Celsius, fino a quando le colonie diventano visibili.

In questo primo esperimento volto a eliminare i geni adiacenti CTXA e CTXB, gli oligonucleotidi per il metodo trans flip sono stati generati come appena illustrato; il ceppo parentale, il ceppo intermedio portatore della cassetta di resistenza antibiotica delimitata da sequenze FRT al posto del locus genico originale di C-T-X-A-B e il ceppo finale privo di C-T-X-A-B e della cassetta di resistenza sono stati tutti sottoposti a verifica del genotipo. Per questo esperimento è stata eseguita una PCR su larga scala utilizzando primer che si legano non al frammento PCR di trasformazione, ma soltanto al DNA cromosomico. I frammenti di PCR sono stati separati mediante elettroforesi standard su aerogel per determinarne la dimensione.

Nella corsia uno, il ceppo di colera di tipo B del mondo era situato alla dimensione prevista del frammento di 3.143 paia di basi. Nella corsia due, il frammento di PCR derivato dal ceppo delta C-T-X-A-B-F-R-T can. FRT era situato a 3.162 paia di basi.

Nella corsia tre, il frammento delta ctx A B FFR TP CR era posizionato a 1.769 paia di basi rispetto al marcatore di 1 kb. Nel secondo esempio, in cui un'intera isola genomica è stata rimossa, è stata scelta l'isola di patogenicità di Vibrio uno o VPI uno come bersaglio per questo esperimento. Il metodo trans flip è stato modificato in due passaggi.

Innanzitutto, l'integrazione del gene di resistenza alla kanamicina è avvenuta mediante un singolo sito FRT all'inizio dell'isola di patogenicità uno. Successivamente è stata eseguita una seconda serie di trasformazione naturale, consentendo l'inserimento di un ulteriore marcatore di resistenza agli antibiotici, ovvero la resistenza alla gentamicina seguita da un secondo sito FRT alla fine dell'isola di patogenicità. Le rispettive coppie di primer sono indicate sopra ciascuna immagine del gel e il metodo trans FLP è proseguito come appena illustrato.

I ceppi parentali, intermedi e finali sono stati tutti verificati mediante PCR del DNA genomico purificato nella corsia uno. Il frammento di PCR del ceppo selvatico di V. cholerae è stato analizzato nella corsia due. È stato analizzato il frammento di PCR risultante dal ceppo VPI uno FRT can GM FRT.

Nella corsia tre è stato analizzato il prodotto PCR derivato dal ceppo delta VPI1 FRT. Le coppie di primer sono indicate sopra ciascuna immagine del gel. Il ceppo finale manca dell'intero VPI1.

Nel terzo esempio, una sequenza di promotore dipendente dalla RNA polimerasi T7 è stata integrata a monte del gene T fox, un regolatore principale della trasformazione naturale, utilizzando il metodo trans flip con una leggera modifica rispetto al protocollo standard. La sequenza consenso del promotore dipendente dalla RNA polimerasi T7 è stata inclusa come estremità sporgenti negli oligonucleotidi numero quattro e numero cinque, in modo che questa sequenza di DNA fosse mantenuta all'interno del cromosoma. Anche dopo l'escissione della cassetta di resistenza agli antibiotici, il costrutto è stato quindi integrato in un ceppo di V colorizzato contenente la RNA polimerasi T7.

In questo ceppo, l'espressione del gene della polimerasi RNA T7 è stata controllata dal promotore LAC UV5 per verificare l'espressione dipendente dalla polimerasi RNA T7 del gene T Fox. I saggi di trasformazione naturale sono stati eseguiti nel mezzo LB. Il ceppo parentale, privo del promotore dipendente da T7 a monte del gene T Fox, non è naturalmente trasformabile in queste condizioni a causa dell'assenza di trascrizione di T FOX in mezzo ricco e in assenza dell'induttore naturale chitina. Questo fenotipo era indipendente dal fatto che la polimerasi RNA T7 fosse o meno indotta artificialmente da IPTG.

Tuttavia, il ceppo con il costrutto trans flip, che contiene il promotore dipendente dalla RNA polimerasi T7 a monte del gene della competenza T fox, era effettivamente naturalmente trasformabile in mezzo arricchito a causa della perdita di repressione del promotore LAC UV5 in mezzo LB. La RNA polimerasi T7 prodotta aveva già trascritto T fox a partire dal promotore dipendente dalla RNA polimerasi T7 anche in assenza di induzione con IPTG. Ciò ha innescato la competenza naturale e la trasformazione, confermando la funzionalità della sequenza del promotore dipendente dalla RNA polimerasi T7 integrata nel genoma.

Questo fenotipo è stato significativamente potenziato dall'induzione completa della polimerasi T7 grazie all'aggiunta dell'induttore del promotore LAC UV5, IPTG. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come manipolare geneticamente *V. cholerae* utilizzando una combinazione di trasformazione naturale indotta da chitina e ricombinazione flip. Una volta padroneggiata, questa tecnica consente di eliminare geni o isole genomiche, nonché di integrare sequenze di DNA in modo sito-diretto in soli pochi giorni.