Misura di attività del Fattore V nel plasma umano usando un saggio di coagulazione Microplate

L'obiettivo generale della seguente procedura era sviluppare un saggio in micropiastre che misuri l'attività del fattore della coagulazione V durante la formazione di un coagulo di fibrina nel plasma umano. In risposta a una lesione, il processo di coagulazione del sangue viene attivato e determina una serie di reazioni di conversione da zimogeno a proteasi che portano infine alla generazione dell'enzima della coagulazione trombina; la trombina scinde il fibrinogeno solubile in monomeri di fibrina, che successivamente si associano per formare un coagulo di fibrina insolubile. Normalmente, il sangue rimane un liquido facilmente fluente nello stato sano o non lesionato, e la quantità di fibrina formata è pari alla quantità di fibrina degradata o scissa.

Tuttavia, in alcune condizioni patologiche, un'eccessiva coagulazione porta a malattie cardiache e ictus, mentre una scarsa coagulazione provoca tendenza al sanguinamento, che si osserva spesso nelle emofilie. Il fattore V è una proteina presente nel plasma che, nella sua forma attivata fattore cinque A, agisce come un acceleratore fondamentale della generazione di trombina durante la formazione del coagulo di fibrina, come parte del complesso enzimatico della protrombina. Quest'ultimo è costituito da quattro componenti: il fattore 10 A, il fattore cinque A (proteasi), il cofattore lipidico, la superficie e il calcio. Il fattore cinque A aumenta l'efficienza catalitica o kcat del fattore 10 A verso il suo substrato protrombina di circa 3000 volte, potenziando così in modo significativo la generazione di trombina e la formazione del coagulo di fibrina.

La piattaforma a micropiastre è preferita per misurare eventi catalizzati dagli enzimi grazie alla praticità, al risparmio di tempo, ai piccoli volumi di campione, al monitoraggio continuo e all'elevata produttività. L'evento di formazione del coagulo di fibrina può essere monitorato mediante un lettore a micropiastre misurando l'aumento dell'assorbanza della luce nel plasma, che passa da un aspetto giallo limpido, in assenza di coagulo di fibrina e con minima assorbanza della luce, a un aspetto opaco e torbido, con coagulo di fibrina e massima assorbanza della luce. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi manuali con provette inclinabili o i saggi con analizzatori automatici, sono la rapidità, il basso costo, i ridotti volumi di campione necessari e l'elevata produttività.

Il saggio misura l'attività del fattore V attivato in modo non intenzionale e del fattore V attivato dalla trombina, al fine di ottenere una valutazione quantitativa completa della sua attività funzionale totale. A illustrare questa tecnica sarà Derek Tilley, uno studente magistrale del laboratorio. Per misurare l'attività del fattore V in un campione di plasma, è necessario costruire le curve standard dell'attività del fattore V in un solo stadio, riguardo al tempo di formazione del coagulo di fibrina nel pannello A e alla velocità iniziale di formazione del coagulo di fibrina nel pannello B, utilizzando plasma umano normale o NHP come standard, il quale contiene per definizione un'unità di attività del fattore V per mL. Scongelare il plasma deficitario di fattore V, il plasma umano normale, i campioni di plasma di concentrazione sconosciuta e la tromboplastina a 37 gradi per 10 minuti.

Mescolare delicatamente il plasma carente del fattore V e il tromboplastino, trasferirli in vassoi di plastica separati e incubare sul ghiaccio. Conservare il plasma umano normale e i campioni di plasma di concentrazione sconosciuta sul ghiaccio dopo un leggero mescolamento. Conservare il cloruro di calcio 25 millimolare in acqua distillata in un vassoio separato a temperatura ambiente per le curve standard di attività del fattore V nel saggio in un solo stadio.

Preparare 200 microlitri di ciascuna diluizione seriale a due fold di plasma umano normale, da 0, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 e 512 volte, in HBS pH 7,4 utilizzando provette microcentrifuga da 1,5 ml, vortexare accuratamente e incubare sul ghiaccio. Per i campioni plasmatici di concentrazione sconosciuta, preparare 200 microlitri di ciascuna diluizione 40 volte di plasma umano normale e di plasmi campione sconosciuti in HBS pH 7,4 utilizzando provette microcentrifuga da 1,5 ml. Inserire cinque strisce micropiastre nel supporto porta-strumento del lettore per micropiastre.

Accendere il lettore di micropiastre e accedere al software applicativo per micropiastre Softmax Pro utilizzando una pipetta multicanale. Aggiungere contemporaneamente 50 microlitri di plasma deficitario del fattore V in tutti i pozzetti del campione sulla micropiatra utilizzando una singola pipetta; aggiungere 50 microlitri delle 10 diluizioni seriali preparate di plasma umano normale e delle diluizioni 40 volte di plasma umano normale e dei campioni di plasma incogniti in pozzetti separati della micropiatra utilizzando una pipetta multicanale; aggiungere 50 microlitri di tromboplastina in tutti i pozzetti del campione. Incubare nel lettore di micropiastre a 25 gradi Celsius per un minuto, agitando durante i secondi 15-25 del minuto di incubazione.

Utilizzare il software applicativo Softmax Pro per microplacche collegato al lettore di microplacche tramite computer. Impostare il lettore di microplacche sulla lunghezza d'onda di assorbanza a 405 nanometri, in modalità cinetica a 25 gradi Celsius, e programmare il lettore affinché agiti per i primi cinque secondi dopo l'aggiunta di cloruro di calcio e misuri l'assorbanza a 405 nanometri ogni cinque secondi per sei minuti. Successivamente, l'intervallo di agitazione di cinque secondi non viene incluso nei tempi di coagulazione calcolati; utilizzando contemporaneamente due pipette multicanale, aggiungere 50 microlitri di cloruro di calcio alle due strisce di microplacca contenenti i campioni.

Attendere 15 secondi e premere immediatamente l'icona di avvio in Softmax Pro dal computer per iniziare il saggio. Per ogni campione di plasma analizzato, viene determinato il tempo di formazione del coagulo, definito come il tempo in secondi necessario per raggiungere l'aumento massimo al 50% dell'assorbanza. La velocità iniziale di formazione del coagulo è definita come la velocità di aumento dell'assorbanza nei primi cinque punti temporali della porzione lineare dell'aumento dell'assorbanza rispetto al tempo.

L'estensione della formazione del coagulo è definita come la differenza tra l'assorbanza massima e quella minima raggiunte durante l'evento di formazione del coagulo alla fine della corsa. Utilizzare i profili di assorbanza in funzione del tempo in Softmax Pro per determinare il tempo, la velocità iniziale e l'estensione della formazione del coagulo per la diluizione seriale di plasma umano normale. Per costruire le curve standard di attività del fattore V in un'unica fase, utilizzare i tempi di coagulazione del plasma umano normale diluito 40 volte e dei campioni di plasma incognito per interpolare l'attività del fattore V in unità per millilitro dalla curva standard di attività del fattore V in un'unica fase.

Questo rappresenta l'attività del fattore V in una singola fase o in assenza di attivazione intenzionale da parte della trombina. Questo è un esempio rappresentativo della formazione del coagulo di fibrina nel saggio del fattore V nel tempo, generato dal lettore di micropiastre. Il profilo rappresenta la formazione del coagulo di fibrina utilizzando plasma umano normale diluito 32 volte in una singola micropiastra.

Bene, l'asse verticale indica la variazione di assorbanza a 405 nanometri verificatasi in seguito alla formazione del coagulo di fibrina. Il tempo di formazione del coagulo è stato calcolato come il punto medio della curva dell'assorbanza in funzione del tempo, pari a 36,4 secondi. La velocità iniziale di formazione del coagulo è stata calcolata come 611,88 unità al minuto.

L'estensione della formazione della turbidità è stata calcolata come 0,35 unità. Il saggio del fattore cinque misura con precisione la velocità iniziale e l'estensione della formazione della turbidità. L'ispezione delle pozzette al termine del saggio ha confermato che si è verificata la formazione di coaguli.

Tutte le reazioni hanno raggiunto un grado pressoché identico di formazione del coagulo, con una variazione generale dell'assorbanza a 405 nanometri compresa tra 0,35 e 0,45 unità tra l'assorbanza iniziale prima e l'assorbanza massima dopo la tromboplastina e il cloruro di calcio. Vengono riportati esempi rappresentativi dell'attività monostep del fattore V, della curva standard del tempo di coagulazione in secondi rispetto all'attività del fattore V in unità per millilitro e della velocità iniziale di formazione del coagulo in milliunità al minuto rispetto all'attività del fattore V in unità per millilitro per il plasma umano normale, mostrati rispettivamente nel pannello A e nel pannello B.

Dal momento che il fattore V è normalmente attivato con trombina, un secondo saggio dopo l'aggiunta e l'incubazione con trombina è fondamentale per misurare con precisione l'attività a due stadi del fattore V in un campione di plasma, attivato intenzionalmente mediante l'aggiunta di trombina per il saggio a due stadi del fattore V. Preparare da 200 a 300 microlitri di trombina purificata alla concentrazione finale di cento nanomolari in HBS pH 7,4 e incubare sul ghiaccio; diluire 120 microlitri del plasma umano normale sopra indicato e dei plasmi campione da 40 a 100 volte con 170 microlitri di HBS pH 7,4 contenente 2,8 millimolari.

Cloruro di calcio. Aggiungere 10 microlitri di trombina per ottenere una concentrazione finale di 10 nanomolari in ogni campione. Vortexare bene per mescolare e incubare a 37 gradi per un minuto; diluire il plasma umano normale e i plasmi campione di 500 volte aggiungendo 400 microlitri di HBS a pH 7,4.

Determinare il tempo di coagulazione del plasma umano normale in ciascun saggio dei campioni di plasma incognito a partire dai profili di assorbanza rispetto al tempo ottenuti con Soft Max Pro. Tenendo conto della diluizione 500 volte, utilizzare il tempo di coagulazione di ciascun campione per calcolare l'attività del fattore V a due stadi a partire dalla curva standard del fattore V a una stadio, che riporta il tempo di coagulazione in funzione dell'attività. Questo valore rappresenta l'attività del fattore V a due stadi, ovvero quella con attivazione intenzionale da parte della trombina.

L'attività totale del fattore V può quindi essere calcolata come l'attività del fattore V a due stadi meno l'attività del fattore V a un solo stadio. La curva standard del tempo di coagulazione in logaritmo rispetto all'attività del fattore V in logaritmo è stata utilizzata per misurare l'attività del fattore V nel plasma umano normale e nei plasmi di nove pazienti con coagulazione intravascolare disseminata o CID; tutti e nove i pazienti con CID hanno mostrato attività del fattore V a un solo stadio e velocità iniziali di formazione del coagulo ridotte in media del 54% e del 18%. L'attività del fattore V a due stadi e quella totale sono risultate ridotte nei pazienti con CID in media del 44% e del 42% rispetto al plasma umano normale.

Il fattore cinque e i pazienti con DIC hanno determinato un tempo prolungato e una riduzione della velocità di formazione del coagulo fibrinico. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona idea di come implementare questo metodo nel proprio laboratorio. Il metodo può essere facilmente adattato per misurare l'attività di qualsiasi fattore della coagulazione nel plasma, risultando così adatto a un'ampia gamma di applicazioni di ricerca e cliniche.

Infine, queste informazioni sul fattore V avranno un impatto positivo sugli ambienti sanitari grazie a una diagnosi e un trattamento più precoci di disturbi trombotici o emorragici come la CID.