A primaria del sistema cultura Neuron per lo Studio della latenza del virus Herpes Simplex e la riattivazione

Lo scopo di questo esperimento è dimostrare come un sistema di coltura cellulare primaria di neuroni possa essere utilizzato per studiare la latenza e la riattivazione del virus dell'herpes simplex. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto i neuroni dei gangli cervicali superiori da embrioni RA e coltivando i neuroni isolati da gangli dissociati dopo l'eliminazione delle cellule non neuronali. Viene stabilita un'infezione latente da HSV utilizzando un virus EGFP per infettare i neuroni in presenza di un inibitore della replicazione litica.

Il passo successivo consiste nell'indurre la riattivazione delle colture infette latenti. Infine, l'efficienza della riattivazione viene valutata monitorando l'espressione di EGFP nel tempo. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano come diverse vie di segnalazione neuronale regolino la latenza e la riattivazione del virus dell'herpes simplex attraverso l'uso di inibitori chimici, interferenza dell'RNA e trasferimento genico.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente studi dettagliati delle interazioni che regolano la latenza del virus dell'herpes simplex nella neurone ospite a livello molecolare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della latenza dell'herpes simplex, come ad esempio quali sono i segnali che agiscono per reprimere il genoma latente e come viene innescata la riattivazione a livello molecolare? Nei neuroni, questo metodo può fornire informazioni sulla latenza dell'HSV-1.

Può essere applicato anche ad altri alfa-herpesvirus neurotrofi. A dimostrazione della procedura, interverranno Marigo, Kochi e Julian Kim, tutti studenti laureati nei nostri laboratori. I gangli cervicali superiori, o neuroni SCG, per questo protocollo vengono isolati da cuccioli di ratto E21 rimossi dall'utero di una femmina di ratto gravida. Lavorando sotto cappa da dissezione, sacrificare ogni cucciolo puntando le forbici alla base del collo appena sopra le spalle e staccando la testa dal tronco. Per esporre i gangli, utilizzare aghi da 23 gauge per fissare la testa, con il collo rivolto verso l'alto, in tre punti.

Prima fissare il midollo spinale. Secondo, tirare la pelle anteriore sul naso e fissarla con un perno, e terzo fissare l'esofago e la trachea lontano dalla parte posteriore del collo. Cercare il ganglio cervicale superiore (SCG) localizzando la biforcazione dell'arteria carotidea.

L'arteria carotide è una struttura pari. Ci sono due biforcazioni su ciascun lato del collo, quindi due CGS s per pop. Il CGS si trova appena sotto il ramo.

Separare il ganglio cervicale superiore dalle arterie staccando la biforcazione usando le due estremità. Il ganglio cervicale superiore è traslucido e incolore rispetto al tessuto adiposo opaco e giallastro che circonda la biforcazione. Posizionare i gangli in 12 millilitri di L 15.

Mezzo integrato con glucosio in un tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio. Dopo aver raccolto tutti i gangli sensitivi cefalici dagli embrioni e averli trasferiti delicatamente, centrifugare i gangli per un minuto. A 600 giri al minuto, rimuovere il mezzo in eccesso di Reese.

Sospendere i gangli in un millilitro di L 15. Mezzo contenente tripsina e collaghenasi. Incubare per 24 minuti a 37 gradi Celsius.

Agitare ogni otto minuti. Successivamente, aggiungere 10 millilitri di mezzo marino per inattivare la centrifuga della tripsina per un minuto. A 600 giri al minuto, rimuovere la maggior quantità possibile del mezzo di collagenasi tripsina e lavare i gangli con 10 millilitri di mezzo C, centrifugando per un minuto a 600 giri al minuto.

Ripetere questo lavaggio una volta. Rimuovere il mezzo di lavaggio e risospendere i gangli in un millilitro di mezzo C per dissociare, tritando con un ago da 21 gauge collegato a una siringa da cinque millilitri per un massimo di 15 cicli su e giù. Completare la triturazione con un ago da 23 gauge fino a quando la maggior parte degli aggregati si è dissociata.

Rimuovere eventuali aggregati cellulari residui filtrando i neuroni dissociati attraverso un filtro in nylon da 70 micron in un tubo conico da 50 millilitri. Prelievarne un'aliquote da 10 microlitri della sospensione cellulare filtrata, aggiungere tripan blu per determinare il numero di cellule vitali. Contare il numero di cellule che escludono attivamente il colorante utilizzando un emocitometro.

Successivamente, distribuire da 5.000 a 6.000 cellule vive totali in 100 microlitri di mezzo C in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, pre-ricoperta con collagene e laminina, aggiungendo 50 nanogrammi per millilitro di fattore di crescita nervoso nel mezzo C. Incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius; il giorno successivo, giorno uno in vitro (DIV uno), verificare l'adeguato attaccamento dei neuroni e la crescita di alcune proiezioni assonali.

Sostituire il mezzo C nei pozzetti con 50 microlitri di mezzo neurobasale o NBM contenente NGF Acho e cinque fluoro due doxi uridina. Sostituire il mezzo una fila alla volta per assicurarsi che le cellule non si secchino. Incubare le colture a 37 gradi Celsius per cinque giorni.

Monitorare quotidianamente la coltura per verificare la morte delle cellule non neuronali e la crescita dei neuroni. Per iniziare questa parte della procedura al sesto giorno in vitro, verificare che la maggior parte delle cellule di supporto non neuronali sia stata eliminata. È estremamente importante minimizzare in ogni momento manipolazioni fisiche non necessarie dei neuroni.

La rimozione e la sostituzione del mezzo devono essere eseguite in modo molto delicato e lento, altrimenti lo stress meccanico risultante potrebbe compromettere la vitalità dei neuroni. Aggiungere aciclovir o un CV al mezzo esistente in ogni pozzetto fino a una concentrazione finale di 100 micromolare. Aggiungere il CV lentamente e delicatamente per garantire che la forza meccanica non influisca negativamente sulle cellule nel giorno successivo.

Al sette DIV, infettare le colture di SCG con un HSV ricombinante di tipo uno che esprime un reporter EGF fuso alla proteina lítica virale US11 a una multiplicità di infezione compresa tra uno e due. Aggiungere il virus diluito direttamente al mezzo esistente nel pozzetto. Includere un controllo infettato con placebo e un'infezione litica.

Controllo positivo in un mezzo privo di CV. Lasciare procedere l'infezione per due o tre ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, sostituire il mezzo di infezione con NBM fresco contenente NGF e un CV. È fondamentale essere estremamente delicati durante il cambio del mezzo di infezione. Inclinare la piastra verso di sé e rimuovere lentamente il mezzo dal fondo della pozzetta.

Quindi indirizzare la punta della pipetta contro la parete del pozzetto anziché sul fondo del pozzetto, permettendo al mezzo di scivolare delicatamente sulle cellule. Sostituire una fila di mezzo alla volta per evitare che le cellule si secchino. Reintrodurre le colture nell'incubatore, maneggiandole con la massima delicatezza per non compromettere la loro capacità di sostenere la latenza dell'HSV-1.

Mantenere le colture per sei giorni a 37 gradi Celsius, periodo durante il quale il virus stabilirà la latenza. Durante questo intervallo, utilizzare un microscopio a fluorescenza per monitorare l'espressione di us 11 EGFP come indicatore della replicazione litica.

Come previsto, non dovrebbe esserci espressione di GFP nel controllo infetto con placebo. S 11 EGFP dovrebbe essere rilevato solo nell'infezione. Le pozzette del controllo positivo prive di trattamento CV indicano un'infezione primaria riuscita e una replicazione litica produttiva.

Per valutare la riattivazione al 14° giorno in vitro (DIV), sostituire con attenzione il mezzo contenente un CV con mezzo fresco privo di CV, come in precedenza. Indirizzare la punta della pipetta verso la parete del pozzetto piuttosto che verso il fondo del pozzetto e permettere al mezzo di scivolare delicatamente sulle cellule, se appropriato. Includere variabili farmacologiche o biologiche come LY 2 9 0 0 4 a 20 micromolari.

Non dovrebbe essere rilevata alcuna espressione di GFP nelle colture infettate in forma latente trattate con A CV. Reintrodurre le cellule a 37 gradi Celsius per un periodo di cinque-sei giorni. Monitorare le colture vive mediante microscopio a fluorescenza per rilevare i neuroni che stanno andando incontro a riattivazione.

La frequenza di riattivazione viene calcolata contando il numero di pozzetti contenenti neuroni positivi per EGFP ed esprimendola come proporzione rispetto al numero totale di pozzetti del campione. Questa figura illustra un esempio in cui lo statina trigger, un noto induttore di riattivazione, viene applicato a colture di gangli cervicali superiori (SCG) infettati in fase tardiva. La riattivazione è stata monitorata e valutata mediante microscopia a fluorescenza ogni giorno dopo il trattamento farmacologico per un periodo di cinque giorni.

Con il TSA, la riattivazione raggiunge il 50% del massimo entro due giorni e, entro cinque giorni, raggiunge il 60% del valore basale o della riattivazione spontanea rappresentata dal DMSO. Le colture di controllo trattate sono circa al 10% in questo esperimento e in genere variano dal 5% al 20% utilizzando questo sistema in vitro. Inoltre, le colture di gangli cervicali superiori (SCG) infette in fase tardiva sono state trattate con LY 2 9 0 0 4.

Culture di riattivazione con riattivazione indotta da LY, note come induttori, sono state confrontate con quelle trattate con l'inibitore della sintesi del DNA virale, acido fosfonacetico, e con i due composti insieme, come illustrato qui. L'espressione di US 11 EGFP è compromessa dal PAA in culture indotte a riattivare con LY 2 9 4 0 0 2, indicando che l'espressione di US 11 EGFP dipende dalla replicazione del DNA virale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante prestare molta attenzione alla tecnica asettica e manipolare la coltura di CG con la massima delicatezza per evitare un aumento della riattivazione spontanea indotta da stress o movimenti meccanici. Dopo aver seguito questa procedura per stabilire infezioni latenti da HSV-1 e neuroni in coltura, altri metodi come l'interferenza a livello di S-H-R-N-A, il silenziamento genico e l'espressione ectopica di geni selvatici e mutanti possono essere eseguiti al fine di caratterizzare le funzioni neuronali che regolano la latenza e la riattivazione di HSV-1.

Non dimenticare che l'HSV di tipo 1 è un patogeno umano che richiede precauzioni di sicurezza di livello PSL 2. Dovresti essere familiare con il lavoro in condizioni PSL 2 prima di eseguire questa procedura. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire colture SCG per instaurare infezioni latenti da HSV di tipo 1 e di come indurre efficacemente la riattivazione nei neuroni.