L'uso di cistometria in piccoli roditori: A Study of Chemosensation vescica

Lo scopo di questa procedura è determinare l'influenza di composti chimici sulle funzioni di stoccaggio e svuotamento della vescica. Questo obiettivo viene raggiunto impiantando innanzitutto un catetere nella vescica. Dopo un breve periodo di recupero, una soluzione controllo viene infusa attraverso il catetere per 30 minuti.

Mentre la pressione intravesicale e il volume espulso vengono registrati per ulteriori 30 minuti, l'animale viene infuso con un composto di interesse. In definitiva, i risultati possono mostrare come sostanze irritanti influenzino anche il modello di minzione attraverso l'analisi della frequenza minzionale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la registrazione della contrattilità della vescica isolata, è che la funzione di questo organo può essere studiata in condizioni più fisiologiche.

Ad esempio, vengono preservate le azioni regolatorie del sistema nervoso centrale. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi chirurgici sono difficili da apprendere, in quanto richiedono l'osservazione di numerosi dettagli tecnici e manovre per garantire il successo dell'esperimento. Per preparare il tubo da impiantare nella vescica, tagliare innanzitutto un tubo PE 50 alla lunghezza desiderata e posizionare un piccolo pezzo bianco di catetere di calibro 18 sopra il catetere principale.

Quindi creare un piccolo manicotto all'estremità riscaldando a fiamma un'estremità del tubo e lavarlo con soluzione salina per eliminare qualsiasi bolla d'aria. Ora indurre l'anestesia in un ratto femmina di 10-12 settimane con isoflurano. Dopo l'induzione anestetica, impostare il livello di mantenimento dell'isoflurano.

Posizionare l'animale in posizione supina e applicare una piccola maschera per anestesia realizzata con una siringa da 10 cc. Dopo aver rasato l'addome e disinfettato il derma, procedere con l'intervento chirurgico. L'intervento chirurgico seguente viene eseguito sia su ratti che su topi nello stesso modo.

Cominciare eseguendo una laparotomia mediana inferiore per esporre la vescica. Successivamente inizia la parte più critica dell'intervento chirurgico. Sotto un microscopio chirurgico, posizionare un punto a borsellino sulla cupola della vescica utilizzando un filo monofilamento non riassorbibile di calibro sei zero.

Successivamente, utilizzando un ago, eseguire una piccola cistostomia all'interno del punto a borsa. Inserire il catetere PE 50 con manicotto attraverso questa apertura. Tubi catetere più sottili, come il PE 10, possono presentare una resistenza maggiore e più variabile, pertanto non sono raccomandati.

Fissare il punto a nodo corsetto intorno al tubo utilizzando un nodo chirurgico. Quindi estrarre delicatamente il catetere verso l'esterno finché la punta con palloncino non si trovi esattamente sotto il punto di sutura. Un segmento di catetere di calibro 18 viene spinto verso il punto di sutura per evitare perdite.

Verificare la presenza di perdite tra il catetere e la vescica. Infondere delicatamente soluzione salina. Irrigidire ulteriormente con punti di sutura aggiuntivi in caso di perdite.

Ora, chiudere i muscoli addominali utilizzando suture monofilamento, lasciando un passaggio per il catetere nella parte superiore dell'incisione. Far passare il catetere nella regione interscapolare mediante un'asta metallica cava, impedendo così agli animali di mordere il tubo. Dopo l'intervento chirurgico, l'asta metallica deve essere posizionata sotto la pelle e sopra i muscoli addominali e dorsali.

Spingere la sonda sottocutaneamente fino alla regione interscapolare. Completare l'intervento chirurgico chiudendo i muscoli addominali e la cute con suture monofilamento non riassorbibili. È ora molto importante verificare la permeabilità e la stabilità del catetere impiantato, lavandolo con soluzione fisiologica.

La soluzione infusa deve uscire dalla vescica, attraversando l'uretra. Dopo aver somministrato l'analgesico per via sottocutanea, chiudere l'estremità esterna del catetere con un film di plastica e fissare il catetere alla pelle della parte bassa della schiena del ratto. Infine, permettere all'animale di riprendersi per 30 minuti.

Prima di iniziare la citometria, assicurarsi che gli strumenti siano stati correttamente calibrati. Posizionare il ratto in una gabbia metabolica sopra un contenitore che contiene olio e che poggia su una bilancia digitale. Il passo successivo consiste nel collegare il catetere impiantato a un rubinetto a tre vie tramite un connettore a baionetta.

Il rubinetto deve essere collegato al trasduttore di pressione e a una pompa di infusione. Il trasduttore di pressione è ulteriormente collegato, tramite un amplificatore, al sistema di acquisizione dati e a un computer che utilizza un software disponibile pubblicamente per iniziare le misurazioni di controllo avviando la pompa di infusione per instillare soluzione salina nella vescica. Per un periodo di 30 minuti, la gabbia metabolica viene sospesa sopra una bilancia digitale, utilizzata per stimare il volume urinato dal ratto.

La pressione intravesicale viene registrata durante il riempimento e lo svuotamento della vescica. Nel passaggio successivo, i farmaci possono essere somministrati per via sistemica o intravesicale per altri 30 minuti di raccolta dati. Al termine dell'esperimento, l'animale deve essere sacrificato.

Un tracciato tipico della pressione registrato in un ratto mostra che durante l'infusione del fluido, si verifica un lento aumento della pressione nella vescica fino al raggiungimento di una certa soglia. A quel punto, la vescica si contrae e lo sfintere urinario si apre, consentendo il passaggio della soluzione instillata attraverso l'uretra. In questo modo, la vescica viene svuotata.

La contrazione si arresta e la pressione scende nuovamente al livello basale. I dati raccolti da un topo presentano tutte le stesse caratteristiche. La citometria è stata utilizzata per identificare i bersagli molecolari dell'olio di senape, o MO, un composto altamente reattivo che è stato a lungo impiegato nei modelli sperimentali di infiammazione e iperalgesia di organi viscerali come la vescica urinaria.

Come previsto, un'infusione intravesicale di MO a 10 millimolari ha indotto una forte diminuzione dell'intervallo contrattile nei topi di tipo selvaggio. Curiosamente, i topi carenti del recettore del MO T RPA A uno hanno mostrato un risultato simile a quello dei tipi selvaggi nelle stesse condizioni. Al contrario, l'MO ha indotto un cambiamento molto più debole nei parametri sistemici in un topo knockout di TRP V uno rispetto al topo di tipo selvaggio; i doppi knockout di entrambi TRPA uno e TRP V uno erano quasi insensibili alla dose di M mo.

I dati suggeriscono che TRP V1 possa svolgere un ruolo chiave nell'irritazione viscerale indotta da MO. La frequenza media istantanea di minzione prima e durante l'infusione intravesicale di MO conferma questi dati. La frequenza media è relativa a un'infusione di soluzione fisiologica.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante assicurarsi che il catetere rimanga saldamente attaccato alla vescica in modo da evitare fuoriuscite della soluzione infusa nell'addome. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come misurare la pressione intravesicale, che prevede l'impianto di un catetere nella vescica e il posizionamento di animali svegli o anestetizzati su un supporto per citometria sotto perfusione vescicale controllata.