Avidità-based Screening Interaction extracellulare (AVEXIS) per il rilevamento scalabile di bassa affinità extracellulare del recettore-ligando interazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è scoprire nuove interazioni proteiche extracellulari coinvolte nei processi di riconoscimento cellulare, in particolare proteine recettoriali incorporate nella membrana. L'approccio AveXis è progettato per aggirare le affinità di interazione estremamente deboli tipiche di questa classe di interazioni proteiche e il fatto che le proteine di membrana siano difficili da manipolare dal punto di vista biochimico. Questo viene ottenuto innanzitutto compilando una libreria proteica ricombinante delle regioni extracellulari dei recettori di superficie cellulare.

Questo viene ottenuto progettando plasmidi di espressione per produrre le regioni del dominio ecto dei recettori come frammenti solubili, sia come sonde monomeriche biotinilate sia come sonde pentameriche marcate enzimaticamente. Il secondo passaggio consiste nell'esprimere e normalizzare le proteine per renderle pronte per il screening delle interazioni. Tutte le proteine vengono prodotte in cellule mammifere per garantire che vengano aggiunte le modifiche post-traduzionali come legami disolfuro, legami solfidici e glicosilazione.

Una fase cruciale del protocollo consiste nell'assicurare che le proteine esca e preda all'interno della libreria siano tutte normalizzate entro livelli soglia. Segue quindi la parte più interessante, ovvero lo screening di nuove interazioni. Le Bates vengono distribuite in pozzetti individuali di una piastra micro e successivamente vengono analizzate per rilevare le interazioni mediante l'uso della praise.

Successivamente viene eseguito un passaggio di lavaggio. L'ultimo passaggio consiste nell'aggiungere il substrato per l'enzima al fine di rilevare qualsiasi proteina bersaglio catturata negli array di proteine esca. In definitiva, i risultati di un esame VEX possono mostrare quali recettori sulla superficie cellulare sono in grado di formare interazioni di legame e che quindi potrebbero essere coinvolti nei processi di riconoscimento e comunicazione tra le cellule.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi popolari di estrazione proteica, come il sistema di due ibridi nel lievito o le purificazioni biochimiche, è che essa è stata progettata specificamente per rilevare interazioni proteina-proteina extracellulari. È particolarmente adatta per scoprire nuove interazioni tra proteine recettoriali ancorate alla membrana. Queste interazioni sono difficili da rilevare con altre tecniche poiché le proteine di membrana sono biochimicamente difficili da manipolare e le loro interazioni con i recettori corrispondenti sono tipicamente estremamente deboli.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardanti il modo in cui le cellule riconoscono e comunicano tra loro. A livello molecolare, può essere utilizzato per rispondere a domande relative a processi biologici di base, come ad esempio quali proteine recettoriali espresse sulla superficie di uova e spermatozoi si legano tra loro, oppure quali interazioni tra recettori e ligandi sono responsabili di comportamenti cellulari come la fusione dei miociti o la formazione della cresta neurale. La principale difficoltà di questo approccio consiste nel compilare le librerie proteiche di esca e di preda all'interno delle quali effettuare la ricerca di interazioni.

È inoltre molto importante assicurarsi che le proteine esca e preda siano normalizzate entro i livelli soglia richiesti per il saggio. Questo riduce la frequenza di risultati falsi negativi e falsi positivi. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo durante il mio dottorato, quando stavo cercando di identificare un partner d'interazione per la proteina di superficie cellulare CD 200.

Fondamentalmente, mi stavo ponendo la domanda: qual è il profilo di legame per questo particolare recettore di superficie cellulare? Ancora oggi? Questa rimaneva all'epoca una domanda tecnicamente difficile da rispondere. Tuttavia, il genoma umano era ormai prossimo al completamento e mi resi conto che, poiché disponevamo ormai di un elenco completo di tutti i recettori di superficie cellulare presenti nel genoma, avremmo potuto invece chiederci, all'interno di questo insieme di proteine recettrici, quali potessero interagire tecnicamente.

Questa è una domanda molto più facile da rispondere, e AveXis era il metodo che abbiamo sviluppato per rispondervi. Una volta ottenuta una libreria di vettori di espressione per l'esca e per il pre, preparatevi a trasfettarli in cellule HEC 2 9 3 E iniziando a seminare le cellule il giorno precedente la trasfezione a una densità di 250.000 cellule per millilitro in 50 millilitri di mezzo freestyle 2 9 3 per garantire un'efficiente eluizione della biotina. Integrate il mezzo utilizzato per produrre le proteine esca, non le proteine preda, con d-biotina; una volta pronte tutte le piastre, incubate le cellule tutta la notte in condizioni standard.

Dato che la biotina ha una bassa solubilità e una soluzione accurata, si preferisce pesare la biotina aggiuntiva e quindi aggiungerla al mezzo agitando vigorosamente il giorno successivo. Trasfettare 50 millilitri di cellule in coltura con 25 microgrammi del plasmide esca o preda utilizzando un reagente di trasfezione adeguato per produrre esche biotinilate; effettuare la cotrasfezione del costrutto esca in un rapporto di 10 a 1 con plasmidi che codificano una forma secreta della proteina ELI, ligasi della biotina, prima del raccolto.

Le colture a cinque giorni dal transfezione vengono dapprima chiarificate centrifugando le cellule a 3000 volte la forza di gravità per 20 minuti e successivamente filtrando il surnatante S attraverso un filtro da 0,22 micron. Una delle caratteristiche principali di AveXis è che, poiché le proteine ricombinanti sono secrete, possono essere diluite o concentrate entro soglie di attività. Abbiamo osservato che le proteine ricombinanti presentano un'espressione variabile fino a quattro ordini di grandezza; pertanto, il passaggio di normalizzazione riduce l'insorgenza di falsi positivi durante le fasi di screening.

Per iniziare la normalizzazione dell'esca, la desbiotina non coniugata deve essere rimossa dal mezzo mediante dialisi, poiché competerebbe con l'esca biotinilata per il legame ai siti di legame della streptavidina. Iniziare fissando l'esca in un tubo da dialisi. Per garantire una dialisi efficace delle proteine ricombinanti, abbiamo riscontrato che è importante fornire un'elevata superficie al tubo da dialisi. Tipicamente, utilizziamo da due a tre volte più tubo di quanto effettivamente richiesto per il volume da dializzare.

Nel corso di un periodo di 24 ore, dializzare abbondantemente l'esca contro un buffer idoneo, come PBS, dopo aver eseguito la dialisi. Un ELIZA inizia bloccando le pozzette di una piastra microtiter codificata con streptavidina con PBST contenente BSA per 15 minuti. Nel frattempo, su una piastra pulita, preparare una serie di quattro diluizioni uno a tre delle proteine esca in PBST con BSA al 2%.

Dopo l'incubazione di 15 minuti, trasferire la diluizione nella piastra codificante strep TTR e incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente; trascorsa un'ora, lavare le pozzette e quindi aggiungere a ciascuna pozzetta 100 microlitri di OX 68 a due microgrammi per millilitro. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ulteriore ora. Al termine della seconda incubazione, eseguire un'altra serie di lavaggi e aggiungere alla piastra l'anticorpo anti-US coniugato con fosfatasi alcalina.

Incubare la piastra per un ulteriore ora a temperatura ambiente. A questo punto, lavare la piastra tre volte con PBST ed eseguire un ultimo lavaggio con PBS. Per rimuovere qualsiasi residuo di detergente, aggiungere 100 microlitri di substrato 1 0 4 a una concentrazione di un milligrammo per millilitro nel buffer di dietanolammina dopo un'ora.

A temperatura ambiente, misurare l'assorbanza a 4 0 5 nanometri. Una serie di diluizioni di quattro diversi sobbrenatanti di esca dializzati è stata rilevata mediante ELISA utilizzando un anticorpo monoclonale anti-tag CD4. Se le proteine di esca espresse non diluite non sono sufficienti a saturare tutti i siti di legame della biotina su una piastra rivestita con streptavidina, concentrare la proteina utilizzando un concentratore Viva-spin. In caso contrario, utilizzare la proteina di esca a una concentrazione diluita in PBST con il 2% di BSA.

Questa quantità è sufficiente per saturare il sito di legame della biotina nel saggio. Quantificare i livelli relativi di espressione delle preproteine utilizzando l'attività enzimatica della beta-lattamasi. Iniziare preparando una serie di diluizioni del sopernatante contenente le paraproteine in tampone PBST con 2% BSA.

Quindi aggiungere 20 microlitri della diluizione a 60 microlitri di una soluzione di nitros stepin caricata in una piastra. Trasferire immediatamente la piastra in un lettore di piastre e misurare l'assorbanza a 485 nanometri una volta al minuto per i successivi 20 minuti utilizzando concentratori centrifughi o PBST diluito con 2% BSA. Impostare la concentrazione finale dei campioni in modo da idrolizzare tutti i nitros nel saggio in circa sette minuti, pari a circa due turnover di nitros al minuto.

Avviare la schermata AveXis lavando una piastra rivestita con strep TAVR ENC in PBST e asciugando la piastra tamponandola delicatamente su un tovagliolo di carta. Successivamente, aggiungere PBST con BSA in ogni pozzetto e incubare la piastra per 30 minuti. Questo passaggio blocca i siti di legame proteici spurii.

In ciascun pozzetto, rimuoveremo la soluzione di blocco con un rapido movimento della piastra sopra un lavello e aggiungeremo 100 microlitri di esca monomerica biotinilata normalizzata nei pozzetti appropriati. Incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere i campioni di esca dalla piastra con un altro rapido movimento e lavarli tre volte con PBST.

Quindi asciugare tamponando dopo il terzo lavaggio. Aggiungere ora 100 microlitri del costrutto preda pentamerico normalizzato in ogni pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora. Trascorsa un'ora, eseguire altri tre lavaggi con PBST e un lavaggio finale con PBS soltanto.

Infine, aggiungere 60 microlitri di soluzione nitrosa sette in ogni pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per due ore, oppure, preferibilmente, incubare le piastre per 16 ore a quattro gradi SIU. Il giorno successivo, le interazioni positive saranno diventate rosse. Scattare una fotografia della piastra per ottenere una documentazione visiva, quindi quantificare le reazioni a un'assorbanza di 485 nanometri utilizzando un lettore di piastre.

Dopo circa 10 minuti dall'inizio della reazione di screening AveXis, si sono osservati cambiamenti di colore dal giallo al rosso sia nel controllo dell'acquisizione dell'analita mediata da anticorpo sia nell'interazione del controllo positivo. Questo cambiamento di colore indica l'idrolisi del nitrito nel substrato. Alcune interazioni positive sono osservabili su questa scala temporale, ma la maggior parte richiede alcune ore per apparire.

Di norma, si osserva un tasso di riscontro di circa lo 0,4-0,6% di positivi. Una volta preparate le librerie proteiche, la fase di screening di questa tecnica può essere eseguita rapidamente. È del tutto possibile esaminare fino a 12 piastre in un giorno dopo aver identificato un'interazione.

Il passo successivo più importante è innanzitutto dimostrare che l'interazione può essere ripetuta utilizzando preparazioni proteiche indipendenti e fresche. In secondo luogo, verifichiamo sempre se l'interazione è indipendente dall'orientamento esca-prede, ovvero se può essere reciproca. Ciò richiede il clonaggio dei domini del vettore esca nel vettore preda e viceversa.

Si ritiene che le interazioni che possono essere ripetute e reciprocate siano ad alta affidabilità e sono sempre state dimostrate positive. Utilizzando altre tecniche come la risonanza plasmonica di superficie, preferiamo impiegare la risonanza plasmonica di superficie per convalidare ulteriormente tutte le interazioni che identifichiamo nuovamente. È importante sottolineare che questo approccio dimostra come i due componenti purificati possano interagire direttamente e può inoltre essere utilizzato per mostrare che il legame è saturo e quindi specifico.