Una tecnica di microscopia TIRF per Real-time, Imaging simultanea del TCR e delle sue proteine ​​associate segnalazione

In questo video viene descritta una procedura per monitorare gli eventi di segnalazione del recettore delle cellule T mediante acquisizione simultanea a doppio canale. Le cellule T vengono innanzitutto trasfettate con un plasmide che codifica per ZAP-70 marcata con GFP, utilizzando la microscopia a fluorescenza con riflessione totale interna, o microscopia TURF. Viene quindi preparato un bilayer lipidico supportato su vetro, che incorpora peptidi ancorati ai lipidi, complessi peptidici-MHC, molecole di adesione e molecole co-stimolatorie.

I linfociti T trasfettati con ZAP-70 vengono aggiunti al doppio strato quando i recettori per linfociti T vengono legati da complessi peptidici MHC. Le catene CD3 associate al recettor per linfociti T vengono fosforilate dalla chinasi LCK della famiglia SARC, e la chinasi ZAP-70 viene reclutata dal citoplasma. Il recettore per linfociti T viene quindi marcato fluorescentemente e viene eseguita l'acquisizione di immagini, immergendo le cellule in un mezzo con indice di rifrazione inferiore rispetto al vetrino e illuminandole con un fascio laser ad un angolo che subisce riflessione totale interna.

Questo genera un'onda evanescente all'interfaccia vetro-acqua, che decade esponenzialmente nel mezzo, consentendo una profondità di penetrazione di 100-200 nanometri. Pertanto, vengono eccitate solo le molecole fluorescenti nella membrana plasmatica o molto vicine ad essa. L'analisi delle immagini ottenute rivela che la trasduzione del segnale avviene in microaggregati del recettore per la cellula T.

Il vantaggio principale della microscopia TIRF o della microscopia confocale convenzionale è che si ottiene una risoluzione migliore, tale per cui i cluster di segnalazione o i complessi di segnalazione come i microcluster del TCR sono facilmente visualizzabili. Travis Crites e Chen, entrambi ricercatori post dottorato nel mio laboratorio, mostreranno come trasfettare linfociti T primari di topo utilizzando la tecnologia di nucleofezione maxi e quindi osservarli mediante microscopia a fluorescenza con riflessione totale interna, o TIRF, stimolati con un bilayer di lipidi su vetro contenente antigene.

Questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare la trasduzione del segnale in diversi tipi di cellule immunitarie, tra cui cellule T, cellule B, linfociti natural killer e cellule mast. Il metodo è ampiamente applicabile e può essere impiegato per studiare la maggior parte dei sistemi recettoriali nelle cellule di mammifero, specialmente quando la trasduzione del segnale avviene in aggregati. Le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero inizialmente incontrare difficoltà, poiché le cellule T sono molto difficili da trasfettare.

Inoltre, è richiesta una coordinazione precisa affinché la vitalità dei linfociti T e l'efficienza di trasfezione, la qualità del bilar e l'allineamento del microscopio siano adeguati. Il primo passaggio di questa procedura consiste nel trasfettare linfociti T primari naïve o attivati in vitro con plasmidi di espressione che codificano per molecole di segnalazione marcate con GFP, utilizzando un kit nucleofettore per linfociti T di topo AM maxa. Tutti i linfociti T utilizzati in questo studio esprimevano il recettore A-N-D-T-C-R che riconosce il peptide MCC legato alla molecola MHC IE di K. La procedura di trasfezione qui descritta viene eseguita seguendo le raccomandazioni del produttore.

Tuttavia, vengono presentati alcuni suggerimenti che favoriscono la vitalità delle cellule T dopo la trasfezione. Sia la vitalità che l'efficienza di trasfezione sono più elevate nelle cellule T attivate in vitro rispetto alle cellule naive e, pertanto, questo protocollo utilizza cellule T attivate in vitro prima di iniziare. Preparare due millilitri di mezzo per cellule T supplementato per ogni trasfezione, mescolando 1,9 millilitri di mezzo fornito nel kit, 20 microlitri del componente A, 20 microlitri del componente B e 100 microlitri di siero fetale bovino in un tubo da due millilitri.

Trasferire due millilitri di mezzo in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per almeno un'ora, in modo che il mezzo raggiunga l'equilibrio; la morte cellulare si verificherà se le cellule transfezionate vengono sospese in un mezzo freddo o non a un pH di 7,2. Per preparare la miscela di transfezione, unire 82 microlitri di soluzione nucleo-effettore per linfociti T murini con 18 microlitri del supplemento due e cinque microgrammi di DNA plasmidico privo di endotossine, a una concentrazione non inferiore a 0,5 microgrammi per microlitro, mescolando accuratamente per semplice agitazione.

Trasferire da cinque a dieci milioni di cellule in un tubo da centrifuga da 15 millilitri, centrifugare a 75 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, utilizzare un aspiratore a vuoto per rimuovere il più possibile il sopranatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare nella miscela di trasfezione, aspirando lentamente il pellet da tre a quattro volte fino a quando non rimangono grumi cellulari di grandi dimensioni. Utilizzando una pipetta, trasferire con attenzione la sospensione in un vete amaxa certificato, assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria.

Chiudere il qve e selezionare il programma nucleare effettore X 0 0 1 sul dispositivo nucleo effettore. Inserire il vete nel portavete Q e premere il pulsante per applicare il programma selezionato. Successivamente, trasferire immediatamente il vete e il mezzo di coltura pre-equilibrato nell'incubatore.

Utilizzando la pipetta di plastica fornita, aggiungere circa 500 microlitri di mezzo pre-equilibrato alla provetta. Quindi aggiungere la sospensione cellulare al mezzo nella piastra, goccia a goccia.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per quattro ore per consentire un'espressione a basso livello delle proteine marcate con GFP e per minimizzare la comparsa di artefatti dovuti a sovraespressione. In questa sezione, viene descritto un metodo per allineare il microscopio per l'acquisizione simultanea di immagini a due canali prima di accendere tutti i componenti del microscopio. Avviare il computer e il software.

Quindi assicurarsi che tutti i componenti hardware siano riconosciuti dal software. Poiché il software si avvia senza messaggi di errore, tutti i componenti sono stati rilevati. Diluire un microlitro di sub resolution.

Aggiungere le microsfere fluorescenti multicolor Flores in due millilitri di PBS per utilizzarle come standard di codestinazione. Quindi aggiungere 0,25 millilitri della sospensione di microsfere in ciascun pozzetto di un sistema di camere da otto pozzetti con coprivetrino. Posizionare il sistema di camere sulla piattaforma sopra l'obiettivo.

Quindi mettere a fuoco sulla preview in tempo reale le perle assorbite sul vetro. Il riquadro a sinistra è il canale in cui saranno visibili le cellule trasfettate con GFP. Il riquadro a destra mostrerà il TCR marcato durante gli esperimenti di imaging su cellule vive.

Utilizzando l'allineamento Y del lancio della fibra XY, Z, regolare la posizione del fascio laser in modo che il fascio emerga dall'obiettivo e venga proiettato sul soffitto. È importante eseguire questa operazione quando l'obiettivo si trova nella posizione in cui il piano di vetro è a fuoco. Se il fascio sul soffitto è diffuso, il fascio non è collimato.

Regolare il micrometro Z per ottenere un perfetto allineamento del test di collimazione per ciascuna delle linee laser da utilizzare nell'esperimento. Quindi, utilizzando un misuratore di potenza laser, regolare la potenza laser a 20-30 microwatt per ogni canale. Le cellule T sono estremamente sensibili alla radiazione laser e l'illuminazione è limitata a un totale combinato di 50 microwatt.

Successivamente, regolare l'angolo per il tappeto erboso. Ruotare il micrometro di allineamento Y sul lancio della fibra per spostare il fascio lontano dal soffitto fino a quando l'angolo, rispetto all'asse ottico dell'obiettivo, si avvicina ai 90 gradi.

Una volta raggiunto l'angolo critico per la riflessione totale interna, la luce del laser non uscirà più dall'obiettivo. Per valutare se l'allineamento del prato è stato ottenuto, focalizzare in alto e in basso attraverso il piano del vetrino. Si noti che, quando i microsfera assorbiti sulla superficie vengono portati fuori fuoco, molte microsfere risultano visibili in sospensione nella soluzione. Per ottenere un buon allineamento del prato, è necessario aumentare l'angolo del fascio rispetto all'obiettivo.

Quando l'angolo del fascio aumenta, le perline che galleggiano vicino alla superficie iniziano a scomparire e l'intensità delle perline assorbite all'interfaccia aumenta. Ora, quando le perline assorbite all'interfaccia vengono portate fuori fuoco, non rimangono visibili perline che galleggiano in soluzione. A questo punto, il campione è correttamente allineato, poiché solo le perline assorbite sul vetrino coprioggetto possono essere a fuoco.

Successivamente, per allineare i canali fluorescenti rosso e verde l'uno rispetto all'altro, concentrarsi sulle perle e confrontare la posizione di elementi identificabili nelle immagini prodotte in entrambi i canali. Utilizzando le viti micrometriche X e Y su un supporto della telecamera, portare la posizione relativa delle perle nella massima prossimità possibile. Qui, osservare la perlina luminosa nel quadrante in basso a sinistra di entrambe le immagini per garantire l'allineamento spaziale tra i due canali.

Questa caratteristica viene portata alla stessa posizione relativa in entrambe le immagini. Acquisire e salvare l'immagine da entrambi i canali. Queste immagini verranno utilizzate come standard di codistribuzione per allineare i due canali.

Un esempio di questo allineamento è visibile qui prima dell'allineamento. Uno dei canali è ruotato rispetto all'altro, come mostrato in questa immagine in cui le immagini dei due canali dei punti quantici sub-risoluzione sono sovrapposte. Dopo le regolazioni, le immagini sono allineate come mostrato qui.

La qualità dell'allineamento può essere ulteriormente esaminata confrontando le immagini di cellule vive trasfettate con GFP. Osservare come i podi Laila dei due canali siano perfettamente allineati, dopo aver allineato le due immagini utilizzando la calibrazione stabilita mediante le microsfere fluorescenti.

Dopo aver configurato il microscopio, si preparano camere a flusso contenenti bicapidi lipidici supportati su vetro che presentano l'antigene e si esegue la tecnica turf M per visualizzare inizialmente l'interazione tra linfociti T TRANSFETTATI e il substrato. Seguendo il protocollo descritto da Ana e Dustin, assemblare una camera a flusso con bicapidi lipidici planari formati su un cover slip di vetro contenente lipidi NI NTA, la molecola di adesione ICAM uno e complessi peptidici MHC. Gli IEFK carichi di MCC vengono incorporati nel bicapide mediante i tag istidinici.

Viene incorporata la molecola co-stimolatrice CD 80. Utilizzando un ancoraggio GPI, posizionare la cella a flusso sul portapreparati del microscopio e stabilizzarla fissando la camera a una piastra adattatrice sul portapreparati mediante un'asticella di tensione per immobilizzarla. Successivamente, collegare l'elemento riscaldante fornito dal produttore alla cella a flusso per controllarne la temperatura.

Posizionare l'obiettivo su un bilayer e mettere a fuoco il piano del bilayer per attivare il riscaldamento dell'obiettivo e dell'apparato a flusso; accendere i riscaldatori dell'apparato a flusso e dell'obiettivo per portare la temperatura della camera a 37 gradi Celsius. Dopo quattro ore di incubazione, trasferire i linfociti T sezionati in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a una velocità di 80 ×g. Risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone H-B-S-B-S-A. Quindi aggiungere H 57 FAB o il frammento variabile a catena singola H 57 per etichettare il TCR a una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro per il FAB o di 20 microgrammi per millilitro per il frammento variabile a catena singola.

Trasferire le cellule in una provetta da cinque millilitri. Successivamente, utilizzando una siringa da un millilitro con ago a punta liscia, iniettare le cellule nella camera di flusso attraverso una valvola a tre vie. Impostare le condizioni di acquisizione in modo che l'acquisizione vitale a doppio canale mostri un'anteprima in tempo reale dei canali TCR e GFP e individuare un campo con cellule transfezionate.

A causa delle differenze di intensità tra TCR e GFP, la scala delle immagini potrebbe dover essere regolata in tempo reale in modo da visualizzare le cellule in entrambi i canali. Come nel caso illustrato, confermare l'illuminazione uniforme focalizzando il piano di vetro per rilevare eventuali colorazioni della membrana laterale. Se le membrane laterali non entrano a fuoco, allora l'allineamento del campo è corretto.

In questa anteprima in tempo reale, la colorazione della membrana laterale è evidente sia nel piano del vetrino coprioggetto sia quando il coprioggetto viene messo fuori fuoco per allineare correttamente il microscopio alla zona di interesse. L'angolo del laser rispetto all'obiettivo viene aumentato e la membrana laterale va fuori fuoco. Iniziare ad acquisire singole immagini e sequenze a intervallo con un intervallo di 10 secondi.

Le cellule sono state incubate per cinque minuti su bilayer di INTA supportati su vetro contenenti sei molecole per micrometro quadrato di peptide caricato con istidina marcato IEFK, 100 molecole per micrometro quadrato di istidina marcata con Alexa 647 ICAM-1 e 100 molecole per micrometro quadrato di CD80 ancorato tramite GPI. È stata eseguita una microscopia TIRF a due canali con acquisizione simultanea in presenza continua del frammento FAB H57 coniugato ad Alexa 546.

Per la colorazione delle cellule TCR, le immagini sono state acquisite fino a un'ora dopo il contatto iniziale con il bilayer. Il numero di aggregati di ZAP 70 per cellula è stato analizzato utilizzando un software automatizzato per il conteggio degli aggregati. In ogni caso, sono state analizzate almeno 40 cellule.

I peptidi caricati sono indicati nell'insetto. ICAM uno si riferisce a cellule su bistrati contenenti 100 molecole per micrometro quadrato di Alexa 647 coniugato. His taggato ICAM uno come mostrato nella figura, la segnalazione dipendente da zap 70 si verifica in microaggregati del TCR e solo in risposta a ligandi agonisti, come si può osservare in questo filmato, acquisito a 10 secondi per fotogramma.

Il segnale del TCR in risposta a peptidi agonisti è sostenuto dalla continua generazione di microaggregati di TCR nella periferia dell'area di contatto, che reclutano ZAP 70. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come trasfettare linfociti T primari utilizzando una tecnologia di trasfezione nucleare maxa e di come effettuare correttamente l'immagine del reclutamento di molecole di segnalazione GFPT nei microaggregati di TCR mediante microscopia turf. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sette ore se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è fondamentale ricordare di trattare con estrema delicatezza le cellule primarie. Maggiore sarà la vitalità delle cellule a ogni passaggio dell'esperimento, maggiore sarà l'efficienza di trasfezione e il numero di cellule che si riuscirà a catturare nell'immagine. Le cellule T sono altamente mobili e, di conseguenza, l'acquisizione sequenziale delle immagini nei canali TCR e GFP provoca un allineamento imperfetto tra le due immagini a causa del movimento dei microcluster di TCR e delle cellule.

Per superare questo problema, abbiamo sviluppato il microscopio TURF a doppio canale con acquisizione simultanea.