Imaging multimodale impianto di cellule staminali nel sistema nervoso centrale di topi

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un monitoraggio standardizzato del comportamento in vivo di cellule staminali trapiantate nel cervello del topo. Questo risultato si ottiene innanzitutto etichettando le cellule stromali derivate dal midollo osseo, che esprimono contemporaneamente EGFP e luciferasi, con particelle fluorescenti di ossido di ferro di dimensioni micrometriche. Il secondo passaggio consiste nell'iniettare in modo appropriato le BMC marcate con MPIO nel tessuto cerebrale del topo.

Successivamente, la sopravvivenza e la localizzazione degli innesti cellulari vengono monitorate in modo non invasivo mediante imaging a bioluminescenza e imaging mediante risonanza magnetica. L'ultimo passaggio consiste nella validazione dei risultati ottenuti con l'imaging in vivo mediante analisi istologica post mortem. Questo metodo può fornire informazioni sul comportamento delle cellule staminali dopo il trapianto nel cervello del topo, ma può essere applicato anche ad altri sistemi, come organismi modello e studi sulle malattie.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le operazioni di manipolazione dell'animale sono difficili da apprendere, in quanto le iniezioni intravenose e intracerebrali sono complesse da eseguire e comportano determinati rischi per la sopravvivenza dell'animale. Per iniziare questa procedura, aggiungere 75 volte 10 alla sesta particelle di ossido di ferro di dimensioni micrometriche di colore blu ghiaccio a una coltura cellulare in crescita subconfluente. Incubare per ulteriori 16 ore per consentire l'assorbimento delle particelle mediante endocitosi, quindi rimuovere le particelle rimanenti con lavaggi.

Lasciare crescere le cellule per ulteriori 24 ore per ottenere una confluenza cellulare e una distribuzione omogenea del G-B-M-P-I-O. Successivamente, utilizzare la microscopia a fluorescenza per validare visivamente l’assunzione delle particelle calcolando il rapporto tra le cellule positive a EGFP e quelle positive al G-B-M-P-I-O rispetto al numero totale di cellule positive a EGFP. In seguito, lavare le cellule BMSC luciferasi EGFP marcate con G-B-M-P-I-O due volte con 10 millilitri.

Trattare le cellule con tripsina EDTA e raccoglierle successivamente. Lavare quindi le cellule e risospendere a una concentrazione finale di 133 volte 10 alla sesta cellule per millilitro in PBS. Infine, mantenere le cellule sul ghiaccio fino al trapianto.

In questa procedura, anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di chetamina a 80 milligrammi per chilogrammo e xilazina a 16 milligrammi per chilogrammo. Attendere cinque minuti affinché il topo si addormenti, quindi rasare la testa per consentire manipolazioni sterili. Successivamente, posizionare il topo in un telaio stereotassico e disinfettare la cute con alcol.

Dopo di ciò, applicare un unguento sugli occhi per prevenire la disidratazione. Eseguire un'incisione mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio al fine di raggiungere l'ippocampo. Praticare un foro nel cranio a due millimetri in posizione posteriore e due millimetri in posizione laterale utilizzando una fresa dentale.

A questo punto, vortexare brevemente la sospensione cellulare, quindi aspirare la sospensione cellulare nella siringa. Successivamente, abbassare la siringa con l'ago a una profondità di 2,5 millimetri sotto la dura madre e lasciare equilibrare la pressione per un minuto. Dopo un minuto, ritrarre l'ago a una posizione di due millimetri sotto la dura madre.

Quindi iniettare tre microlitri di sospensione cellulare utilizzando una pompa automatica di microiniezione alla velocità di 0,70 microlitri al minuto. Dopo l'iniezione, attendere ulteriori cinque minuti per prevenire il reflusso della sospensione cellulare iniettata. Successivamente, ritirare lentamente l'ago.

In seguito, disinfettare i margini della pelle, quindi suturare la cute. Iniettare 300 microlitri di soluzione fisiologica allo 0,9% per via sottocutanea al fine di prevenire la disidratazione. Alla fine, posizionare il topo sotto una lampada riscaldante per consentire il recupero dall'anestesia prima di eseguire l'immagine bioluminescente.

Anestetizzare il topo con una miscela di 3%iso, fluoro e ossigeno. Successivamente, posizionare il topo nell'imager a fotoni. Ridurre il livello di anestesia regolando il fluoro isoflurano al 1,5%. Quindi, iniettare d-lucifero per via endovenosa a 150 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo.

Acquisire l'immagine per cinque minuti utilizzando il software di foto visione. Successivamente, eseguire l'elaborazione dell'immagine utilizzando il software M three visione e quantificare il segnale osservato mediante regioni di interesse fisse. Per eseguire la risonanza magnetica, anestetizzare il topo con 3%ISO fluorina in una miscela di ossigeno e ossido di azoto.

Quindi posizionare il topo nel contenitore di contenimento di un sistema di risonanza magnetica orizzontale da 9,4 Tesla. Ridurre il livello di anestesia regolando l'isoflurano al 1%. Successivamente, applicare un unguento sugli occhi del topo per prevenire la disidratazione. Dopodiché, utilizzare una sonda rettale per monitorare la temperatura corporea.

Quindi posizionare un sensore sotto l'addome del topo per monitorare la frequenza respiratoria. Mantenere la frequenza respiratoria a 110 più o meno 10 volte al minuto e mantenere la temperatura corporea costante entro un intervallo ristretto di 37 più o meno 0,5 gradi Celsius. Quindi posizionare la bobina RF superficiale sulla testa del topo.

Posizionare il mouse al centro del magnete. Successivamente, aprire ParaVision 5.1 e impostare i parametri della sequenza secondo il manoscritto allegato. Quindi acquisire un set di 10 immagini coronali pesate in T2 ottenute con eco di spin per ottenere informazioni anatomiche specifiche.

Acquisire immagini NT con eco di gradiente ponderato in modalità ponderata T2* per studiare la migrazione delle cellule staminali con una risoluzione nel piano di 70 micrometri quadrati. In questo passaggio, sacrificare il topo ed estrarre il cervello. Fissare il tessuto cerebrale a temperatura ambiente in paraformaldeide al 4% in PBS per due ore.

Dopo due ore, disidratare il tessuto cerebrale ponendolo in gradienti diversi di saccarosio a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, congelare il tessuto cerebrale utilizzando azoto liquido e conservare il tessuto a meno 80 gradi Celsius fino al taglio, quando pronto.

Tagliare il tessuto cerebrale in sezioni spesse 10 micrometri utilizzando un criostato. Successivamente, osservare al microscopio a fluorescenza le sezioni criogeniche non colorate per rilevare la fluorescenza blu proveniente dalle particelle G-B-M-P-I-O e la fluorescenza verde proveniente dalle cellule che esprimono EGFP. Quindi, esaminare le sezioni criogeniche non colorate per individuare la fluorescenza di fondo verde rossa proveniente dalle cellule infiammatorie.

La procedura descritta di marcatura con MPIO blu glaciale determina un'etichettatura altamente efficiente delle cellule BMSC, luciferasi EGFP, che può essere facilmente convalidata mediante microscopia a fluorescenza. Successivamente, dopo il trapianto di BMSC marcati con G-B-M-P-I-O, cellule luciferasi EGFP nel sistema nervoso centrale di topi, la sopravvivenza dell'innesto cellulare può essere monitorata mediante imaging bioluminescente in vivo basato sull'attività della luciferasi. Inoltre, la localizzazione esatta delle cellule trapiantate può essere monitorata mediante imaging a risonanza magnetica in vivo, basato sul contenuto di ferro dei MPIO blu glaciale.

Infine, l'analisi istologica mostra la validazione dei risultati ottenuti mediante imaging bioluminescente e imaging mediante risonanza magnetica. La sopravvivenza stabile è stata confermata da un'espressione stabile di EGFP nel tempo dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'imaging molecolare per esplorare eventi cellulari e molecolari dopo il trapianto di cellule staminali in diversi modelli animali di malattie neurodegenerative.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'imaging molecolare, applicando la bioluminescenza e la risonanza magnetica, e di come validare adeguatamente i risultati in vivo mediante valutazione istologica post mortem.