Ottimizzato Analisi della metilazione del DNA e l'espressione genica da piccole aree anatomicamente definiti del cervello

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la metilazione del DNA e le variazioni dell'espressione genica in seguito a stress nella prima fase della vita. Questo viene ottenuto sottoponendo innanzitutto dei topolini neonati a separazione materna per indurre uno stress precoce; successivamente, aree cerebrali di interesse, in questo caso il nucleo paraventricolare (PVN), vengono isolate mediante microdissezione in loco, e il DNA e l'RNA vengono estratti simultaneamente da un singolo campione di tessuto.

Successivamente, il DNA ottenuto viene trattato con solfito e la regione di interesse viene amplificata mediante PCR con solfito. Questo prodotto viene quindi ligato in un vettore e trasformato in batteri. Le trasformazioni riuscite sono identificate mediante l'espressione del marcatore e la dimensione del frammento di PCR.

Infine, il sequenziamento del solfuro di bismuto viene utilizzato per valutare lo stato di metilazione. Il principale vantaggio di questo flusso di lavoro è che consente un'analisi agevole della programmazione epigenetica in risposta a stimoli ambientali. Questo metodo può fornire informazioni sulla programmazione epigenetica indotta da avversità vissute nei primi stadi della vita.

Si può applicare anche ad altri sistemi. Ogni volta che si analizzano metilazione ed espressione genica in ambienti altamente specifici per tessuto e ogni volta che la disponibilità del tessuto è limitata per indurre stress precoce nella vita. La separazione materna viene effettuata su cuccioli nati da femmine C 57 black six N gravide controllate nel tempo al fine di indurre separazione materna.

Trasferire ogni nidiata in una gabbia pulita riscaldata per tre ore al giorno dal primo al decimo giorno postnatale, lasciando i cuccioli di controllo non stressati indisturbati. A parte la separazione di tre ore, tutte le nidiate rimangono con le loro madri fino allo svezzamento al giorno postnatale 21. Successivamente, i cuccioli vengono allevati in gruppi omogenei per sesso, da tre a cinque topi per gabbia, in condizioni standard di allevamento. Per avviare il prelievo del tessuto cerebrale, i cervelli dei topi vengono rimossi dai crani e immediatamente congelati nell'isopentano raffreddato con anidride carbonica solida e conservati a meno 80 gradi Celsius.

Quando si è pronti a raccogliere i campioni di tessuto, rimuovere i cervelli dal congelatore a meno 80 gradi e posizionarli su ghiaccio secco. Iniziare sezionando criogenicamente i cervelli in sezioni coronali di 10 micron da rostrale a caudale. Montare le sezioni su vetrini in vetro super frosts e lasciarle asciugare per la colorazione con violetto di cresta.

È possibile preparare ulteriori vetrini e conservarli a meno 20 gradi per analisi successive, come l'ibridazione in situ. Quando si è pronti per effettuare i prelievi, colorare i vetrini con violetto di cresta per identificare le strutture cerebrali di interesse. Quindi, utilizzando un ago per biopsia, prelevare campioni di 0,8 millimetri delle regioni di interesse mediante microdissezione in loco.

I campioni devono essere conservati a meno 80 gradi Celsius. È di fondamentale importanza che il microforaggio venga eseguito in maniera standardizzata, poiché l'espressione genica e la metilazione sono altamente specifiche del tessuto. Omogeneizzare i campioni in 400 microlitri di buffer tiocianato di guanidina utilizzando una pipetta, quindi vortexare a temperatura ambiente.

Successivamente, far passare il lisato risultante attraverso una siringa da 29 gauge. Dopo diverse passate, il punch non dovrebbe più essere visibile. Dividere il lisato in parti uguali.

Uno per processare l'RNA, che deve essere eseguito per primo, e un altro per processare il DNA, che può essere conservato a temperatura ambiente finché l'RNA non viene processato per la purificazione dell'RNA mediante un decimo di volume di acetato di sodio, un volume di fenolo acquoso e metà volume di cloroformio 24:1 con isoamil alcol. Agitare vigorosamente la miscela dopo ogni aggiunta e incubare la soluzione finale sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, centrifugare la miscela.

Prelevare la fase acquosa e aggiungere un volume uguale di etanolo al 70%. Utilizzando un kit di colonne di centrifugazione per RNA, eseguire la digestione del DNA in colonna, quindi lavare ed eluire l'RNA in 25 microlitri di acqua.

Ora purificare il DNA utilizzando un protocollo di kit modificato per includere l'aggiunta di una digestione con RNasi e per riscaldare il buffer di eluizione e la colonna di eluizione a 70 gradi Celsius prima del loro utilizzo. Sono sufficienti 10 minuti a 70 gradi Celsius per le colonne. Infine, utilizzare uno spettrofotometro per determinare le concentrazioni di DNA e RNA.

Un prelievo tipico dell'PVN fornisce circa 600 nanogrammi di DNA e circa 400 nanogrammi di RA messi da parte, di cui circa 100 nanogrammi di RNA per l'analisi dell'espressione genica mediante PCR quantitativa prima dell'amplificazione mediante solfito. Trattare 200 nanogrammi del DNA isolato con un kit disponibile in commercio per amplificare il DNA proveniente dalle regioni metilate. Ordinare primer progettati specificamente per il DNA convertito con bisolfito. Una progettazione ottimale dei primer nella PCR con bisolfito è essenziale, poiché la qualità e la specificità dell'amplicone PCR determinano il successo dei passaggi successivi.

Quando i primer arrivano, determinarne la temperatura ottimale e di annealing mediante esperimenti pilota. Utilizzare due microlitri di DNA trattato con bisolfito come stampo per ciascuna miscela di PCR da 25 microlitri.

Amplificare la miscela iniziando con una denaturazione di sei minuti a 95 gradi Celsius, seguita da 45-50 cicli di amplificazione prima di un'elongazione finale di cinque minuti a 72 gradi Celsius. Analizzare sette microlitri del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel Agros per verificare le dimensioni dell'amplicone. Purificare il prodotto PCR rimanente per la successiva ligazione utilizzando un kit commerciale per la pulizia del PCR.

Se si ottengono prodotti PCR non desiderati, utilizzare la purificazione su gel per isolare il prodotto di interesse per questo protocollo. Viene impiegato un kit commerciale per il clonaggio. L'efficienza di clonaggio dipende in modo critico dall'inserzione.

Pertanto, se si ottengono ripetutamente bassi numeri di cloni ricombinanti, provare un vettore di clonaggio diverso. Impostare una reazione di ligazione da 10 microlitri con un microlitro di vettore e tre microlitri di prodotto PCR purificato. Mescolare la reazione mediante pipettaggio e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo.

Purificare la reazione di ligazione mediante precipitazione alcolica classica e trasformare i batteri con il prodotto. Aggiungere un millilitro di mezzo SOB preriscaldato immediatamente dopo il trasferimento dell'impulso e trasferire i batteri trasformati in una provetta da reazione. Dopo aver incubato i batteri per un'ora a 37 gradi Celsius, distribuire 100 microlitri di ciascuna sospensione su una piastra di LB con ampicillina rivestita con IPTG.

Incubare le piastre durante la notte in modo che le colonie possano essere prelevate. Impostare reazioni PCR da 25 microlitri in una piastra a 96 pozzetti utilizzando tre microlitri di cloruro di magnesio 2,5 millimolare per ogni reazione. Selezionare le colonie bianche positive con la punta di una pipetta e trasferirle in una miscela PCR con una semplice immersione.

Iniziare la PCR con un ciclo di denaturazione della durata di quattro minuti. Successivamente, eseguire 10 cicli di amplificazione con una temperatura di appaiamento di 56 gradi Celsius. Ogni fase di questi cicli dura 30 secondi.

Quindi ridurre la temperatura del coperchio termico a 48 gradi Celsius per ulteriori 30 cicli di amplificazione. Concludere con un ciclo di allungamento di cinque minuti. Caricare ora cinque microlitri di ciascun prodotto su un gel ad aros e identificare le reazioni che contengono l'inserto di dimensioni corrette.

Utilizzare un kit disponibile in commercio per purificare i prodotti PCR di interesse in modo che possano essere sequenziati mediante sequenziamento ciclico con terminatore big dye. In una piastra a 96 pozzetti, caricare i pozzetti con tre microlitri di mix master per la reazione big DI, seguiti da due microlitri di prodotto PCR coloniale purificato. Eseguire la reazione su un termociclatore partendo da un minuto a 96 gradi Celsius, seguito da 35 cicli di 10 secondi a 96 gradi Celsius, cinque secondi a 50 gradi Celsius e quattro minuti a 60 gradi Celsius.

Al termine della reazione con big die, purificare la reazione utilizzando una piastra di purificazione per big die. Dopo aver ottenuto le sequenze, analizzarle mediante il big analyzer online o lo strumento B-I-S-M-A per determinare il profilo di metilazione della regione di DNA analizzata, al fine di comprendere l'influenza dello stress precoce della vita o ELS sull'espressione e sullo stato di metilazione del gene VP. I topi C 57 black sticks sono stati processati seguendo il protocollo descritto; i nuclei paraventricolare e sopraottico sono stati prelevati per isolare il DNA e l'R-N-A-D-N-A è stato trattato con bisolfito, amplificato con primer specifici per l'enhancer del gene VP e i prodotti di PCR sono stati clonati e sequenziati, analizzando almeno 20 cloni ricombinanti per ogni topo.

Le PCR sono state analizzate per determinare le frequenze di metilazione dei CPG contenuti nell'amplicone PCR in tessuti provenienti da P-V-N-E-L-S, che ha indotto una significativa ipometilazione in quattro posizioni sull'enhancer di A VP, suggerendo una marcatura epigenetica di questa regione regolatoria attraverso esperienze precoci di vita. In contrasto con il PVN, la metilazione dell'enhancer di A VP non è risultata influenzata dall'ELS nel SON, illustrando la specificità tissutale dell'effetto epigenetico. Negli animali di controllo, lo stato di metilazione del DNA al CPG 10 ha mostrato una correlazione negativa con l'espressione genica di a VP, indicando un ruolo della metilazione del DNA nella modulazione fine dell'espressione genica di a VP. Seguendo questa procedura, altri metodi come la UPCR possono essere facilmente eseguiti sull'RNA isolato per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio i cambiamenti nell'espressione genica nel tessuto analizzato.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare le variazioni della metilazione del DNA in risposta a stimoli ambientali o legati all'esperienza.