Rilevamento di Rare varianti genomiche da Sequencing pool Uso SPLINTER

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare geni all'interno di una popolazione di individui che mostrano una prevalenza di variazioni funzionali rare. Questo viene ottenuto innanzitutto raggruppando una popolazione di campioni di DNA. Il secondo passaggio consiste nella creazione e nel sequenziamento di una libreria per il sequenziamento di nuova generazione.

Successivamente segue l'allineamento delle letture alla sequenza di riferimento e la creazione di un modello di errore. L'ultimo passaggio consiste nell'analisi computazionale mediante l'algoritmo splinter. Infine, l'analisi splinter del sequenziamento massivo di nuova generazione viene utilizzata per identificare geni all'interno di popolazioni che presentano una preponderanza di varianza funzionale rara, dimostrando così la procedura.

Oggi sarà Francesco Vilania, uno studente laureato nel laboratorio del mio mentore e collaboratore, Rob Mitra, affiancato da Enrique Ramos, uno studente laureato nel mio laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i genotipi di singoli individui, è che consente di rilevare con grande precisione varianti di sequenza rare in una popolazione mista di molecole di DNA senza richiedere alcuna informazione preliminare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della genetica e della genomica, ad esempio come determinare la frequenza di nuove varianti rare responsabili di malattie in studi su ampie coorti.

Ogni esperimento con frammenti richiede la presenza di un controllo negativo e positivo per ottenere un'accuratezza ottimale; preparare la miscela di reazione PCR utilizzando la DNA polimerasi PFU ultra high fidelity. Il controllo negativo è un prodotto PCR derivato da una qualsiasi sequenza di DNA nota per non presentare variazioni genetiche, come ad esempio un vettore clonato privo di inserto.

Qui viene utilizzato un amplicone di 1.934 paia di basi proveniente dal vettore M13 MP18. Il controllo positivo può consistere in qualsiasi serie di varianti di sequenza precedentemente validate, presenti nell'intera popolazione. Se questi dati non sono disponibili, questo laboratorio ha progettato un controllo positivo artificiale costituito da un prodotto PCR di 331 paia di basi ottenuto da una miscela di sequenze ingegnerizzate clonate nel vettore PGMT easy, come indicato in questa tabella.

Queste sequenze vengono combinate per imitare diverse frequenze alleliche minoritarie di varianti reali all'interno del gruppo di pazienti. Dopo l'amplificazione PCR dei campioni come descritto nel protocollo scritto allegato a questo video, rimuovere ogni prodotto PCR dagli iniziatori in eccesso utilizzando la purificazione con colonnina kyogen kayak quick oppure piastre filtranti a 96 pozzetti con manifold a vuoto per procedure di purificazione su larga scala. Una volta purificati, quantificare ciascun prodotto PCR mediante tecniche standard.

Prepararsi a combinare tutti i prodotti PCR e i controlli in un pool normalizzato per numero di molecole. L'associazione per concentrazione comporterebbe una sovra-rappresentazione degli ampliconi piccoli rispetto ai prodotti più grandi. Invece, raggruppare un numero normalizzato di molecole per ogni amplicone.

Scegliere numeri arbitrari sufficientemente grandi da mantenere l'accuratezza durante la pipettaggio. Recuperare i prodotti PCR e i controlli. La ligazione dei prodotti PCR è necessaria perché la frammentazione di piccoli prodotti PCR probabilmente introdurrà un bias nella rappresentazione a favore dei loro estremi.

Per questo motivo, ligiamo i prodotti PCR di pull in un vettore di grandi dimensioni prima della loro frammentazione. Preparare la miscela per la ligazione a estremità ottuse utilizzando T4 Ligasi, T4 PNK e PEG come indicato nel protocollo. Incubare la reazione a 22 gradi Celsius per 17 ore.

Proseguire con un'incubazione a 65 gradi Celsius per 20 minuti e mantenere a quattro gradi Celsius. Successivamente, verificare la ligazione caricando 50 nanogrammi di campione in un gel ad agarosio. Una ligazione riuscita produrrà una banda ad alto peso molecolare presente nella corsia.

Preparare la frammentazione del DNA mediante una strategia di sonificazione casuale diluendo il campione di 10 a 1 in Qiagen PB Buffer per ridurne la viscosità. Successivamente, frammentare il grande cono di prodotti PCR utilizzando un bio-rupturer a nodo diagonale per 24 campioni, sottoponendo a sonificazione ad alta potenza per 25 minuti con cicli di 40 secondi accesi e 20 secondi spenti al minuto. Verificare i risultati della frammentazione del DNA su un gel di agarosio e procedere con il sequenziamento illuminoso come descritto nel testo.

Per iniziare il sequenziamento, eseguire l'allineamento delle letture. Convertire i file di lettura grezzi del sequenziamento in formato scarf oppure comprimerli. La compressione è facoltativa.

Permette di risparmiare tempo e spazio per i passaggi successivi dell'analisi senza perdere alcuna informazione rilevante. Utilizzando lo strumento di allineamento incluso, allineare le letture grezze alla sequenza di riferimento annotata più veloce. Specifici delle regioni bersaglio sono inclusi le reazioni PCR, nonché i controlli positivi e negativi.

Il formato di input deve essere in formato scarf o compresso. Successivamente, eseguire l'etichettatura dei file come descritto nel testo. Ogni esecuzione genera un profilo unico di errore di sequenziamento che deve essere caratterizzato per effettuare una chiamata accurata delle varianti, modellando gli errori per ogni singola esecuzione.

Viene incluso in ogni libreria di campioni in pool un controllo interno noto per essere utilizzato per la variazione di sequenza. Generare un file di modello di errore utilizzando lo strumento incluso con la sequenza di riferimento del controllo negativo; possono essere utilizzate tutte le sequenze del controllo negativo oppure, in alternativa, solo un sottoinsieme specificato mediante le estremità cinque prime e tre prime. Letture uniche e conteggi pseudo devono essere sempre applicati.

Lo strumento genererà tre file denominati in base al parametro del nome del file di output e che terminano con zero, uno o due. Questi file corrispondono rispettivamente a un modello di errore di ordine zero, primo e secondo per la chiamata di varianti con splinter. Il modello di errore di secondo ordine deve essere sempre utilizzato per la visualizzazione del profilo del tasso di errore della corsa.

Lo script Pearl utilizzato per tracciare il grafico del modello di errore può essere impiegato per generare un grafico degli errori in formato PDF a partire del file del modello di errore di ordine zero. Il file grafico rivelerà andamenti specifici degli errori relativi all'esecuzione e potrà essere utilizzato per dedurre il numero massimo di basi lette per l'analisi. La sezione seguente illustrerà come eseguire splinter sul file allineato utilizzando il modello di errore per rilevare varianti di sequenza rare.

Il primo passo nell'analisi consiste nell'eseguire splinter sul file allineato utilizzando la sequenza di riferimento e il modello di errore. Le basi singole dei read possono essere escluse dall'analisi se risultano difettose. La soglia del valore P determina quanto rigorosa sarà l'analisi di chiamata delle varianti.

Un valore minimo di cutoff di -1,301 è un buon punto di partenza. L'opzione relativa alla dimensione del pool ottimizza la discriminazione segnale-rumore dell'algoritmo eliminando le possibili variazioni con frequenze di alleli minoritari inferiori a quella di un singolo allele nel pool effettivo. L'opzione relativa alla dimensione del pool deve essere impostata al valore più vicino superiore al numero effettivo di alleli analizzati nell'esperimento.

La varianza rilevata a frequenze inferiori verrà ignorata come rumore. Dopo aver inserito tutti i parametri e i nomi dei file, eseguire splinter. Questo file restituisce tutti i riscontri statisticamente significativi nel campione, con una descrizione della posizione e del tipo di variante.

Valore P per la frequenza del filamento del DNA della variante e copertura totale per filamento del DNA. La provetta della lista viene utilizzata da splinter per normalizzare la copertura tra il campione. Il primo campo indica l'amplicone di interesse, mentre il secondo campo indica la posizione in cui è presente la mutazione.

N indica che il resto della sequenza non contiene alcuna mutazione. Per una normalizzazione, l'analisi del controllo positivo è fondamentale per massimizzare la sensibilità e la specificità di un determinato esperimento. Questo è importante perché molto probabilmente il valore iniziale di cutoff di -1,301 non sarà sufficiente per eliminare tutti i falsi positivi.

Ogni analisi dettagliata mostrerà il valore P effettivo per ciascuna variante rilevata, che non poteva essere previsto a priori. Tuttavia, l'intera analisi può essere ripetuta utilizzando il valore P meno stringente visualizzato nell'output iniziale per le posizioni note di basi vere positive. Questo permetterà di mantenere tutti i veri positivi escludendo la maggior parte, se non tutti, i falsi positivi, che tipicamente presentano valori P molto meno significativi rispetto ai veri positivi.

Per automatizzare questo processo, è possibile utilizzare lo script del tester del cutoff. Lo script del tester del cutoff richiede un file di output di splinter e un elenco di risultati positivi di controllo sotto forma di un file delimitato da tabulazioni, simile a quello utilizzato per la normalizzazione. L'output risultante sarà un elenco di cutoff che progressivamente raggiungono quello ottimale.

L'ultima riga rappresenta il cutoff più ottimale per la corsa e può quindi essere utilizzata per l'analisi dei dati. Il risultato ottimale consiste nel raggiungere sensibilità e specificità pari a uno. Tuttavia, se questo non viene raggiunto, l'analisi dello splinter può essere ottimizzata modificando il numero di basi lette incorporate.

Il cutoff finale può essere applicato ai dati utilizzando lo script cutoff cut, che filtrerà il file di output di splinter rimuovendo i riscontri al di sotto del cutoff ottimale. Questo passaggio genererà il file di output finale di splinter, che conterrà gli snips e gli indel presenti nel campione. Si noti che l'output per le inserzioni è leggermente diverso rispetto a quello per le sostituzioni o le delezioni.

L'accuratezza in funzione del coverage per un singolo allele in un campione in pool è visualizzata in questo tipo di grafico. L'accuratezza è stimata come l'area sotto la curva (abbreviata come UC) di una curva ROC e varia da un valore casuale di 0,5 a un'accuratezza perfetta di 1,0. In questo esempio, l'UC è riportata in funzione del coverage per allele per il rilevamento di singoli alleli mutanti in pool di 200 501 000 alleli.

Qui un'UC è rappresentata in funzione del totale per inserzioni, delezioni e sostituzioni. Questo grafico degli errori mostra la probabilità di incorporare una base errata in una posizione specifica. Il profilo di errore mostra tassi di errore bassi con un andamento crescente verso l'estremità tre primi della lettura di sequenza.

Nucleotidi di riferimento notevolmente diversi mostrano diverse probabilità di errore. Questo grafico rivela l'accuratezza di splinter nella stima della frequenza allelica per le posizioni con un coverage superiore a 25 volte per allele. Un confronto tra le frequenze alleliche del DNA in pool stimate da splinter e i conteggi allelici misurati da studi di associazione sull'intero genoma o risultati GWAS.

In una correlazione molto elevata, è stata prelevata una popolazione di 974 individui e sono stati analizzati oltre 20 chilobasi per il sequenziamento. Splinter è stato applicato per il rilevamento di varianti rare. Secondo il protocollo standard, ogni individuo aveva precedentemente subito un genotipaggio mediante concordanza gwas tra il genotipaggio delle varianti marcate e quelle nuove.

I risultati ottenuti nel campione raggruppato sono stati eccellenti. Sono state identificate tre varianti, due delle quali rare nella popolazione, come mutazioni *de novo* a partire dai risultati del sequenziamento, e sono state convalidate mediante sequenziamento pirosequenziale individuale; le frequenze dell'allele minore o la concordanza matematica tra pirosequenziamento e sequenziamento raggruppato sono risultate eccellenti. Una volta terminata l'individuazione delle varianti rare nel campione raggruppato, molte persone desiderano conoscere le conseguenze funzionali delle varianti identificate.

Pertanto, l'annotazione della tua varianza diventa il passo successivo nel processo dopo uno sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del sequenziamento del DNA per studiare varianti rare in modo rapido ed economico, consentendo la caratterizzazione di varianti rare in ampi studi di popolazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come rilevare varianti di sequenza rare in un campione di DNA in pool utilizzando splinter.