Sviluppo di bronchiolite obliterante in un modello murino di trapianto polmonare ortotopico

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire un modello di bronchiolite obliterante che rispecchi il trapianto polmonare ortotopico. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando il polmone donatore da un topo C57BL/10. Il secondo passaggio consiste nel preparare la manichetta per l'anastomosi della bronchi, dell'arteria polmonare e della vena.

Successivamente, il polmone del donatore preparato viene trapiantato nel topo ricevente C five seven BL six. L'ultimo passaggio consiste nell'osservare il topo trapiantato per 21 o 28 giorni dopo il trapianto. Infine, l'analisi istologica viene utilizzata per evidenziare lesioni da bronchiolite ostruttiva nel polmone trapiantato.

Il principale vantaggio di questo modello rispetto al modello di trapianto eterotopico con effetto specchio delle vie aeree è che il modello attuale riproduce la condizione umana. In generale, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché le strutture superiori nei topi sono molto delicate e più soggette a lesioni, in quanto hanno una massa pari a un decimo di quella del ratto. Posizionare il topo donatore in una camera sigillata e indurre l'anestesia con il 5% di isoflurano. Successivamente, utilizzare un catetere endovenoso da 20 gauge per intubare il topo o la trachea, quindi collegarlo a un ventilatore per roditori.

Mantenere l’anestesia con il 1-2% di isoflurano. Dopo aver verificato che il topo sia completamente anestetizzato attraverso l’assenza di risposta allo strappo della coda e alla compressione delle dita dei piedi, posizionarlo in posizione supina e preparare l’addome con alcol al 70%. A questo punto, asportare con una forbice la cute sovrastante l’addome ed esporre la muscolatura addominale.

Successivamente, eseguire una sternotomia laparotomica praticando innanzitutto un'incisione mediana attraverso la parete addominale, quindi tagliando trasversalmente lo sterno; spostare l'intestino verso il basso e individuare la vena cava inferiore, situata appena al di sotto del fegato. Iniettare eparina a una dose di 100 microlitri per chilogrammo nella vena cava inferiore. Successivamente, tirare verso il basso il legamento falciforme del fegato e tagliare il diaframma lungo l'attacco ventrale causale in direzione della colonna vertebrale.

Tagliare entrambi i lati della parete toracica fino al collo per esporre la cavità toracica. Tagliare bilateralmente la gabbia toracica proteggendo il polmone ed asportare il timo. Successivamente, tagliare la VCI intratoracica al livello del diaframma.

Ora localizzare il cuore ed escindere l'appendice auricolare destro. Quindi praticare un'incisione trasversale alla radice del tronco dell'arteria polmonare e utilizzare l'incisione per lavare i polmoni con due millilitri di soluzione fisiologica refrigerata con lattato e 0,1 millilitri di eparina. Esposizione della trachea, quindi resezione della trachea insieme all'esofago.

Ora arrestare la ventilazione a due terzi dell'insufflazione al volume espiratorio terminale. Asportare il cuore in blocco lungo e conservarlo sul ghiaccio. Posizionare una garza sul polmone asportato per proteggerlo dalla luce.

Incidi il legamento polmonare fino alla vena polmonare o pv. Rimuovi l'esofago e l'aorta per localizzare l'ilo. Individua l'arteria polmonare o pa, che si trova nella parte più craniale dell'ilo e al bronco principale ad esso adiacente.

Dissezionare con attenzione l'arteria polmonare dal bronchio. Ora, creare una cuffia PA da un catetere IV da 24 gauge tagliandolo a una lunghezza di 0,5 millimetri con un'estensione di 0,7 millimetri. La superficie della cuffia è intrecciata AB.

Al fine di fornire una superficie per l'anastomosi, realizzare una cuffia per il bronco utilizzando un materiale simile a quello della cuffia dell'arteria polmonare, ma usando un catetere da 20 gauge tagliato a una lunghezza di un millimetro con un'estensione di 0,7 millimetri. La dimensione della cuffia della vena polmonare varia in base al peso del topo donatore. Per topi che pesano da 24 a 27 grammi.

La dimensione del manicotto è di 22 gauge con una lunghezza di 0,7 millimetri e un’estensione di 0,7 millimetri, per topi del peso di 27-32 grammi. Le lunghezze sono identiche, ma si utilizza un catetere di 20 gauge. Inserire ora i manicotti nel distale della lente dell’arteria polmonare, della vena polmonare e del bronco, fissando ciascuno con un punto di sutura in seta 9-0.

Dopo che tutte le cuffie sono state correttamente applicate, avvolgere il polmone donatore preparato in garza imbevuta di soluzione di Ringer lattato e collocarlo sul ghiaccio fino al trapianto. Per preparare il topo ricevente, indurre l'anestesia e posizionarlo sulla ventilazione meccanica nello stesso modo utilizzato per il donatore.

Rasare la parete toracica sinistra e preparare con alcol al 70%. Iniziare praticando un'incisione toracotomica nello spazio intercostale sinistro terzo. Estendere l'incisione in direzione dorsale, vicino alla spina dorsale.

Assicurarsi che il campo operatorio sia coperto in modo sterile e posizionare un clamp per microvasi sui vasi polmonari e sul bronco sinistro adiacenti al cuore. L'arteria polmonare può essere visualizzata nella parte craniale, la vena polmonare all'estremità caudale delilo ilo e il bronco tra di esse. Successivamente, esercitare una trazione delicata con un emostatico per creare una leggera tensione sull'arteria polmonare, sulla vena polmonare e sul bronco.

Mantenere le strutture ilari clampate ed eseguire con attenzione la resezione del polmone sinistro. Isolare l’arteria polmonare, la vena polmonare e il bronco, quindi posizionare una sutura di tipo "oh" in modo lento intorno a ciascuna struttura. Dissezionare completamente l’arteria polmonare dalla sua guaina avventizia, quindi praticare un piccolo incisione trasversale, pari a circa un quarto della circonferenza del vaso, sulla parete anteriore.

Lasciando intatto il proseguimento della parte dorsale dell'arteria, ottenere il polmone donatore, avvolto in garza di cotone imbevuta di soluzione fisiologica fredda, e posizionarlo nella cavità toracica. Successivamente, inserire i manicotti nell'arteria polmonare (pa), nella vena polmonare (PV) e nel bronchio del ricevente per creare l'anastomosi e legarli con sutura nano. Infine, rimuovere il polmone del ricevente.

Rimuovere quindi la pinza trasversale dell'ilo, che consente la riperfusione e la ventilazione. Riposizionare il polmone trapiantato nella cassa toracica del ricevente e chiudere l'incisione toracotomica. Utilizzando un sutura 5-0, il topo dovrebbe ora riprendersi dall'anestesia. La buprenorfina può essere somministrata per il controllo del dolore dopo che il topo ha ripreso conoscenza.

Questa tabella mostra i punteggi istologici del rigetto acuto e la prevalenza della bronchiolite obliterante o OB. Il punteggio del rigetto acuto post-trapianto è indicato come punteggio A. Le combinazioni di innesti allotrapiantati mostrano una patologia di rigetto acuto o cronico notevolmente maggiore rispetto all'innesto ISO. Inoltre, la prevalenza della bronchiolite obliterante è risultata significativamente più elevata nelle combinazioni di innesti allotrapiantati rispetto all'innesto ISO ai giorni 21 e 28 dopo il trapianto.

I reperti macroscopici e l'istopatologia a 28 giorni dal trapianto polmonare sono mostrati qui. Queste immagini rappresentano i reperti macroscopici e il trapianto polmonare ISO colorato con ematossilina ed eosina (H&E), e il polmone destro naïve. Queste immagini rappresentano colorazioni ematossilina-eosina e tricromica di Masson su trapianto polmonare allogenico BL10 in un ricevente murino BL6, che ha sviluppato rispettivamente BOS e assenza di BOS.

La freccia bianca in un B identifica le lesioni OB. Questo pannello mostra un trapianto polmonare da BL6 in un ricevente topo BL10. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa mezz'ora se effettuata correttamente.

L'utilità di questa tecnica consiste nella possibilità di utilizzarla per rispondere a domande meccanicistiche relative alla disfunzione primaria del trapianto, al rigetto acuto e alla bronchiolite ablativa dopo il trapianto polmonare.