Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un dispositivo microfluidico rivestito con cellule endoteliali. Questo viene realizzato innanzitutto fabbricando il calco microfluidico. Il secondo passaggio consiste nel creare il canale in PDMS.

Successivamente, le cellule endoteliali vengono seminate nel dispositivo. L'ultimo passaggio consiste nel coltivare le cellule all'interno del dispositivo. In definitiva, i dispositivi microfluidici rivestiti con cellule endoteliali vengono utilizzati per mostrare le interazioni tra cellula e cellula in vitro.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che fornisce al ricercatore un controllo rigoroso sulle condizioni biologiche e biofisiche ed è compatibile con la microscopia a fluorescenza. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle interazioni biofisiche tra cellule nelle malattie ematologiche, può essere applicato anche a fenomeni come la biologia dei leucociti, la metastasi tumorale e la biologia delle cellule staminali ematopoietiche. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà perché le condizioni devono essere strettamente controllate per ottenere un corretto posizionamento delle cellule.

In previsione della fabbricazione, crea una maschera fotolitografica inviando un'immagine di progettazione assistita da computer del dispositivo microfluidico a un fornitore esterno di maschere. Una volta ricevuta, la maschera è composta da uno strato di cromo su vetro al calce-sodico. Qui, la larghezza del canale microfluidico è di 30 micron.

Per iniziare la fabbricazione del dispositivo microfluidico, pulire un wafer di silicio nudo con soluzione piranha per 15 minuti, quindi risciacquare con acqua deionizzata per 10 secondi. Successivamente, immergere il wafer di silicio in acido fluoridrico per 30 secondi e risciacquare con acqua deionizzata per circa 10 secondi. Poi, utilizzando una spin coater, applicare il fotoresistente micro chem SU 8 20 25 sul wafer fino a uno spessore di 30 micrometri, utilizzando una velocità di rotazione di 3000 giri al minuto.

Posizionare la wafer rivestita con SU 8 20 25 su una piastra riscaldante impostata a 95 gradi Celsius per cinque minuti, per eliminare il solvente in eccesso. Per questo passaggio non si raccomanda l'utilizzo di un forno. Ora, posizionare la maschera fotolitografica sulla wafer ed esporre alla luce UV in un allineatore di maschere, per indurre il reticolaggio del fotoresist SU 8 20 25.

Dopo il cross-linking, riposizionare la wafer sulla piastra riscaldante a 95 gradi Celsius per ulteriori cinque minuti, al fine di accelerare ulteriormente la polimerizzazione del photoresist SU 8 20 25. Successivamente immergere la wafer nel developer SU eight, composto principalmente di P-G-M-E-A, per quattro minuti.

Questo rimuoverà il fotoresist SU 8 20 25 non reticolato. Risciacquare la nuova wafer sviluppata con alcol isopropilico al 100% per 10 secondi, quindi asciugare utilizzando azoto sotto pressione oppure lasciando evaporare il solvente dalla wafer in una cappa chimica pulita per alcuni minuti. A questo punto, fissare la wafer asciutta al centro della piastra di Petri con del nastro, avendo cura di posizionare il nastro ai bordi della wafer.

Infine, pipettare 500 microlitri di sigma coat sul wafer. Coprire la piastra di Petri con il coperchio, quindi agitare delicatamente la piastra per assicurare un rivestimento completo del wafer. Rimuovere il coperchio e lasciare asciugare il wafer per alcuni minuti, fino a quando tutto il solvente sarà evaporato.

Dopo aver mescolato il polimero PDMS e l'agente indurente in un rapporto di 10 a 1 in peso, rimuovere le bolle d'aria utilizzando un essiccatore sotto vuoto per alcuni minuti fino a un'ora, a seconda dell'intensità del sistema a vuoto disponibile. Dopo aver rimosso tutte le bolle d'aria, versare il composto nel contenitore in modo da coprire sia la wafer che la superficie del contenitore. Per ottenere un foglio di PDMS di spessore pari a circa cinque millimetri.

Crea anche un sottile pezzo privo di caratteristiche di PDMS spesso un millimetro. Quindi, polimerizza la miscela in un forno a 60 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno successivo, utilizza un coltello o un bisturi per tagliare intorno alla piastrina e rimuovere più dispositivi microfluidici in PDMS.

Quindi tagliare il foglio per isolare i singoli dispositivi. Tagliare il foglio di PDMS leggermente più grande rispetto al dispositivo microfluidico. Utilizzare ora un trapano a mano Harris Unicorn o un dispositivo simile per creare i fori di ingresso e di uscita nel dispositivo microfluidico.

Successivamente, pulire le superfici del dispositivo microfluidico e del foglio utilizzando nastro adesivo. Quindi utilizzare un pulitore al plasma per esporre le superfici del dispositivo microfluidico e del foglio in PDMS al plasma di ossigeno per 30 secondi. Il plasma di ossigeno genera specie reattive sulla superficie esposta del PDMS, che si legano quando vengono messe a contatto fisico.

Successivamente, riempire una siringa da un millilitro munita di un ago da 20 gauge a punta smussata con 50 microgrammi per millilitro di fibronectina proveniente dal plasma umano in PBS, quindi applicare un tratto di tubo sull'ago. Inserire un pezzo di tubo più sottile nel primo pezzo di tubo per creare un accoppiamento a frizione tra i due pezzi di tubo.

Quindi collegare l'altra estremità del pezzo di tubo più sottile all'ingresso del dispositivo microfluidico. Applicare pressione alla siringa per riempire completamente i canali con la soluzione di fibronectina e formare una piccola goccia di 100 microlitri all'uscita in modo da garantire che i canali rimangano umidi. A questo punto, incubare il dispositivo microfluidico in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per 40-60 minuti.

Dopo l'incubazione, collegare una siringa nuova riempita con PBS all'ago ottuso. Applicare pressione per lavare il dispositivo microfluidico con PBS. Preparare da 500.000 a 2 milioni di cellule per millilitro di cellule endoteliali venose dell'ombelico umano, o hve, in un mezzo di crescita endoteliale con 8% dextran.

L'aggiunta di dextrano aumenta la probabilità che le cellule aderiscano e vengano coltivate con successo all'interno del dispositivo microfluidico. Riempire una siringa pulita con ago a punta smussata e tubo più largo con la sospensione cellulare e collegare un tratto più lungo di tubo, di circa un metro di lunghezza. È fondamentale assicurarsi che il tubo sia ben aderente per eliminare qualsiasi perdita tra le connessioni.

Prima di tutto, riempire il tubo con la soluzione cellulare, assicurandosi che non siano presenti bolle né nella siringa né nei tubi, al fine di ottimizzare le prestazioni del sistema. A questo punto è fondamentale evitare che entrino nel sistema perdite o bolle d'aria. Qualsiasi fuoriuscita di soluzione o presenza di bolle nel mezzo impedirà l'adesione corretta delle cellule endoteliali.

Dopo aver eliminato tutte le bolle e aver riempito l'intera lunghezza del tubo con la sospensione cellulare, posizionare la siringa sulla pompa e collegare l'altra estremità all'ingresso microfluidico. La pompa per siringa viene posizionata alla stessa altezza del dispositivo microfluidico. La lunga estensione del tubo viene avvolta con cura all'interno dell'incubatore per garantire un adeguato riscaldamento delle cellule e del mezzo prima che entrino in contatto con il dispositivo.

Successivamente, la sospensione cellulare viene infusa nel dispositivo microfluidico a una portata volumetrica di 1,23 microlitri al minuto per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica nel nostro sistema. La portata volumetrica di 1,23 microlitri al minuto corrisponde a una velocità media di un millimetro al secondo nei canali più piccoli. Ciò approssima uno sforzo di taglio parietale di un dine per centimetro quadrato in quei canali utilizzando sangue intero.

Al termine dell'infusione della sospensione cellulare, utilizzare la stessa pompa a siringa e il tubo lungo con una siringa più grande per infondere il mezzo di crescita fresco per due fino a otto giorni a un flusso di 1,23 microlitri al minuto. Quando il monostrato cellulare raggiunge il livello desiderato di confluenza, iniettare sangue o sospensione cellulare nel sistema per l'esperimento. Qui, il dispositivo microfluidico è mostrato prima dell'endotelizzazione.

Il dispositivo microfluidico è stato riempito con colorante alimentare per illustrare le dimensioni, la scala e il design complessivo del dispositivo che imita la fisiologia della vascolarizzazione. La microscopia in campo chiaro rivela l'endotelializzazione di un dispositivo microfluidico. Questa immagine è stata acquisita meno di 48 ore dopo la semina, utilizzando il protocollo descritto; la tecnica di perfusione ottimizzata permette alle cellule endoteliali di crescere in maniera confluenziale sull'intera superficie interna del sistema microfluidico.

Entro 24-48 ore dal seeding cellulare. Come mostrato in questa immagine al microscopio confocale, il tumore microvascolare su un chip con microcanali approssima le dimensioni di circa 30 micron dei postcapillari venulari, sede della maggior parte degli eventi ostruttivi microvascolari nella drepanocitosi. In questo esperimento, sangue intero proveniente da pazienti sani viene infuso in una microvascolatura su un dispositivo su chip in condizioni deossigenate.

Questo video mostra che il flusso di sangue intero nel nostro sistema microfluidico endoteliale è regolare, uniforme e continuo, senza aree di ostruzione nei microcanali. Qui, sangue intero proveniente da pazienti affetti da anemia falciforme viene infuso in una microvascolatura su un dispositivo a chip. In condizioni di deossigenazione, si osservano cambiamenti significativi nel flusso sanguigno, con ostruzioni complete presenti in diversi canali.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non introdurre bolle d'aria durante il cambio dei tubi. Il dispositivo finito è compatibile con la microscopia a fluorescenza e può essere adattato a saggi fluorimetrici tradizionali. Questa tecnica apre la strada agli ematologi sperimentali per condurre esperimenti utilizzando singole cellule in un ambiente biophysico e emodinamico controllato.

Nessuna bolla.