Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

L'obiettivo generale di questa procedura è generare e caratterizzare linfociti T a partire da cellule staminali pluripotenti indotte o cellule IPS. Le cellule IPS possono quindi essere differenziate in vitro in un sistema di coltura OP9-DL1 e successivamente maturate in vivo in un topo carente di rag, oppure possono essere ingegnerizzate geneticamente per sovraesprimere il TCR OT-I e quindi trasferite in modo adottivo per lo sviluppo in vivo.

Dopo sei settimane di differenziamento in vivo, i topi possono essere sottoposti a sfida mediante iniezione intraperitoneale di sette cellule tumorali EEG e quindi può essere valutata la specificità antigenica delle cellule T derivate da IPS. In definitiva, le cellule IPS possono differenziarsi sia in cellule T convenzionali che in cellule T specifiche per l'antigene, queste ultime in grado di proteggere gli animali dalla sfida tumorale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'immunoterapia anticancro personalizzata.

Il metodo consente la generazione di un elevato numero di linfociti T reattivi verso il tumore a partire da una minima quantità di sangue o tessuto cutaneo del paziente. Al giorno zero, trasferire 5 × 10⁴ cellule IPS su una piastra da coltura da 100 mm contenente uno strato monocellulare confluito di cellule OP9-DL1 in mezzo alpha MEM con 20% di FBS. Al giorno cinque, trattare con tripsina, centrifugare le cellule dopo averle incubate su una nuova piastra da coltura da 100 mm per 30 minuti in un incubatore a 37 °C, quindi piastrare 5 × 10⁵ delle cellule in sospensione in mezzo alpha MEM con 20% di FBS e ligando murino FLT3 su una nuova piastra da 100 mm contenente uno strato monocellulare di cellule OP9-DL1. All'ottavo giorno, pipettare delicatamente le cellule debolmente aderenti, centrifugare e quindi trasferire le cellule in un singolo pozzetto di una piastra da coltura a sei pozzetti rivestita con cellule OP9-DL1 confluenti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% di CO₂ per altre due settimane. Al giorno 22.

Incubare le cellule IPS staccate in un nuovo piatto di coltura con mezzo fresco a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, rimuovere circa metà delle cellule in sospensione e farle passare attraverso un filtro in nylon da 70 micron per eliminare gli aggregati cellulari, quindi lavare la sospensione di cellule singole risultante tre volte con PBS freddo. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in PBS a una concentrazione di 1,5 × 10⁷ cellule per millilitro e mantenere le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione endovenosa.

Posizionare un topo carente di rag di quattro settimane sotto una luce infrarossa per dilatare la vena della coda. Quindi riempire una siringa da un millilitro dotata di un ago da 26 e mezzo di calibro con 200 microlitri di sospensione cellulare ed effettuare il trasferimento adottivo delle cellule attraverso la vena della coda dilatata. Tre settimane dopo, a seguito della conferma dell'eutanasia del topo a cui è stato effettuato il trasferimento adottivo, rimuovere i linfonodi e la milza dopo aver sottoposto i tessuti a dissociazione meccanica.

Lisare la sospensione monocellulare con un tampone di lisi CK e quindi lavare due volte i monociti risultanti in PBS freddo. Dopo la colorazione per i marcatori di superficie cellulare, valutare le cellule mediante analisi citofluorimetrica al giorno zero; utilizzare il reagente di trasfezione JAMA per trasfettare le cellule impacchettanti platE seminate da un giorno con un OT one MIDR. Al giorno uno, seminare un milione di cellule IPS in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti pre-ricoperta con gelatina 0,1%. Al giorno due, raccogliere il pseudovirus contenente S natin dalle cellule platE e quindi filtrarlo attraverso un filtro da 0,4 micron per escludere potenziali contaminanti dopo la centrifugazione. Trasdurre le cellule in presenza di polibrene per un'ora a 330 ×g a 32 gradi Celsius.

Incubare durante la notte alla stessa temperatura dopo aver ripetuto la procedura di trasduzione. Il quarto giorno, trattare con tripsina le cellule IPS trasdotte e, dopo la formazione del pellet, risospendere le cellule in mezzo fresco e seminarle su cellule feeder SNL 767 pre-codificate e irradiate. Una volta che le cellule trasdotte hanno raggiunto la confluenza, selezionare le cellule doppie positive per GFP e DS red mediante citometria a flusso.

Six settimane dopo il trasferimento adottivo delle cellule IPS, iniettare 50 microlitri di cellule EEG seven thoma nella cavità peritoneale dello stesso topo al giorno 50 della sfida tumorale. Utilizzare un kit di isolamento di cellule T CD8 positivo Mil E Biotech per selezionare le cellule T CD8 positive dalla milza e dai linfonodi dell'animale a cui è stato effettuato il trasferimento adottivo. Mescolare le cellule T CD8 positive isolate con cellule SPOC irradiate provenienti da un topo C57BL/6J naïve in un rapporto di 1 a 10 e stimolare la coltura in co-coltura con 0,5 micromoli per ml di ova per 40 ore.

In seguito, aggiungere il felden A alle cellule per ulteriori quattro ore. Infine, valutare le popolazioni cellulari mediante analisi citofluorimetrica dopo aver isolato le cellule SP da un topo C57BL/6J naïve. Suddividere la sospensione cellulare in due gruppi.

Etichettare il gruppo CFSE alto con cinque micromoli per millilitro di CFSE e stimolare le cellule con 10 microgrammi per millilitro di peptide ova per un'ora; etichettare il gruppo CFSE basso con 0,5 MICROMOLI per millilitro di CFSE e non stimolare. Mescolare 2,5 volte 10 alla sesta cellule CFSE alte con 2,5 volte 10 alla sesta cellule CFSE basse in PBS. Successivamente analizzare le cellule mediante citometria a flusso per l'espressione di CFSE.

16 ore dopo il trasferimento adottivo nel topo di interesse, per contare le cellule tumorali intraperitoneali al giorno 20 della sfida tumorale. Utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago da 18 e mezzo e PBS freddo per lavare la cavità peritoneale. Contare le cellule tumorali recuperate per identificare le cellule infiltranti il tumore.

Rimuovere il tumore in una fase avanzata della sfida tumorale, quindi tagliare il tumore in tre pezzi. Posizionare il primo pezzo del tumore in una provetta criogenica e mettere la provetta sul ghiaccio secco. Fissare immediatamente il secondo pezzo con formaldeide.

Conservare il terzo frammento in mezzo RPMI 1640 condizionato dopo aver fatto asciugare all'aria le sezioni di tessuto criopreservate. Fissarle in acetone freddo per 15 minuti dopo aver lasciato asciugare all'aria le sezioni fissate per altri 15 minuti. Lavare le lamelle per cinque minuti in PBS dopo il lavaggio.

Posizionare i vetrini in una camera umida e coprire le sezioni di tessuto con 30 microlitri di 3% B, SA e PBS per 30 minuti per bloccare il legame non specifico. Quindi asciugare delicatamente il buffer di blocco e incubare le sezioni di tessuto con una miscela di 50 microlitri di anticorpo pe anti TCR RV alpha due e anticorpo fitz anti ova, diluiti in 3% PSA in PBS, nella camera umida per due ore. Alla fine dell'incubazione, lavare i vetrini tre volte in PBS freddo e montare infine le sezioni con un mezzo di montaggio a base acquosa prima dell'esame al microscopio fluorescente per l'analisi citometrica in flusso dei linfociti T infiltranti il tumore.

Sminuzzare il tumore fino a ottenere una sospensione di singole cellule. Successivamente analizzare le cellule per specifici marcatori di superficie. C CD tre e TCR beta vengono utilizzati come marcatori delle cellule T per determinare se la stimolazione di cellule IPS con il ligando della notch DL uno possa contribuire all'espressione sulla superficie cellulare di CD quattro e CD otto su cellule derivate da cellule IPS positive per CD tre e TCR beta positive.

Osservare il diagramma a dispersione a destra che mostra le cellule T singole positive CD3+ TCRβ+ CD4- CD8+ generate da cellule IPS in vitro al giorno 22. Inoltre, le cellule singole positive derivate da cellule IPS della figura precedente hanno prodotto interleuchina 2 e interferone gamma quando sono state stimolate in vitro con anticorpi anti-CD3 legati alla piastra e anticorpi anti-CD28 solubili, confermando che le cellule T derivate da cellule IPS sono funzionali dopo il trasferimento adottivo in topi riceventi. La maggior parte delle cellule IPS trasdotte con il gene del TCR ha subito differenziamento in linfociti T citotossici CD8+, che hanno risposto in vitro alla stimolazione con peptide secernendo interleuchina 2 e interferone gamma, come mostrato in questi diagrammi a dispersione ottenuti da cellule linfonodali e spleniche raggruppate.

I linfociti T CD8 positivi Vβ5 positivi sono stati generati nei topi ai quali sono state trasferite cellule IPS trasdotte con TCR, ma non nelle cellule IPS di controllo trasdotte. Le popolazioni CD8 positive Vβ5 positive erano positive per la colorazione intracellulare delle citochine interleuchina-2 e interferone-gamma, rappresentate in questi istogrammi dalle linee scure, rispetto agli istogrammi di controllo dell'isotipo ombreggiati, indicando che i CTL derivati da IPS erano funzionali. Questi dati mostrano che le cellule CFSE-alte, caricate con eptide e rappresentate dai picchi a destra in ciascun grafico, e le cellule di controllo CFSE-basse, rappresentate dai picchi a sinistra, sono state iniettate nei topi 10 settimane dopo il trasferimento delle cellule IPS oppure un giorno dopo il trasferimento dei CTL OOT1.

I CTL derivati da IPS specifici per l'antigene hanno risposto alla stimolazione antigenica e hanno mostrato attività citotossica, come indicato dall'assenza di cellule CFSE high qui. Le cellule IPS trasdotte con il gene del recettore T OT uno sono state trasferite in modo adottivo in topi C57BL/6 e successivamente i topi sono stati sottoposti a sfida con cellule tumorali OVA7 il giorno 20; le cellule tumorali nella cavità peritoneale sono state enumerate. Si noti la riduzione significativa del numero di cellule tumorali nei topi che hanno ricevuto le IPS trasdotte con il recettore T rispetto ai gruppi di controllo.

Il trasferimento adottivo di cellule IPS TRANSDOTTE da TCR ha innescato soprattutto l'infiltrazione di CTL iperreattivi nei tessuti tumorali e ha protetto gli animali da una sfida tumorale, come osservato in questa colorazione ematossilina ed eosina di tessuti tumorali recuperati dai giorni 30 al 35 dopo la sfida tumorale: tumori da topi sottoposti a trasferimento adottivo di cellule transdotte con TCR o CTL OT1, ma non da topi iniettati con controllo fittizio. Le cellule transdotte sono state infiltrate da cellule infiammatorie, come indicato dalle frecce rosse. Sono stati riscontrati infiltrati di CTL specifici per Ova, positivi per V alpha due (in rosso), nei tessuti tumorali esprimenti Ova (in verde).

Sebbene i tumori nei topi dei gruppi di controllo mostrassero in questa figura un numero ridotto o nullo di cellule infiltranti tumorali, le sospensioni monocellulari provenienti dai tessuti tumorali sono state analizzate per l'espressione della positività per V alfa due e della positività per V beta cinque mediante citometria a flusso, dopo selezione della popolazione positiva per CD8. Si noti che i tessuti tumorali provenienti da topi ai quali erano state trasferite in modo adottivo cellule IPS trasdotte con TCR mostravano il livello più elevato di cellule infiltranti tumorali, mentre i tumori di topi che avevano ricevuto cellule IPS trasdotte con controllo non mostravano infiltrazione da parte di cellule T CD8 positive specifiche per ova.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare linfociti T specifici per l'antigene a partire da cellule IPS e di come valutare le funzioni dei linfociti T derivati da IPS.