Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è posizionare una popolazione di cellule staminali sane adiacenti a un tessuto con cellule staminali ablate all'interno di un parian, al fine di analizzare in vivo il comportamento delle cellule staminali e delle loro progenie durante la rigenerazione. Questo viene ottenuto anestetizzando e immobilizzando un parian non irradiato oppure un parian irradiato con Leafly per ulteriori manipolazioni. Successivamente, il parian non irradiato immobilizzato viene parzialmente schermato con piombo e quindi irradiato con raggi X, generando un parian non danneggiato in cui un tessuto con cellule staminali ablate è adiacente al tessuto schermato, che mantiene le cellule staminali.

In alternativa, un innesto di tessuto prelevato da un donatore non irradiato può essere trapiantato in un ospite precedentemente irradiato al fine di generare un parabiosi con una popolazione isolata di cellule staminali. I risultati ottenuti mostrano popolazioni isolate di cellule staminali adiacenti ai tessuti con cellule staminali eliminate, mediante ibridazione in situ su preparato intero per RNA con sonde per geni marcatori di cellule staminali.

Pertanto, i metodi descritti qui hanno lo scopo di comprendere meglio la rigenerazione nei planari studiando il comportamento delle cellule staminali sia nel paradigma del trapianto sia in quello dell'irradiazione parziale, che ci permette di verificare se i tessuti circostanti e gli ambienti locali in cui risiedono queste cellule staminali influenzino o meno il comportamento di questi neoblasti o cellule staminali. Durante il processo di rigenerazione, da uno a due mesi prima dell'esperimento, nutrire i planari secondo il manoscritto allegato. Per ottenere le dimensioni desiderate in questa dimostrazione, si selezionano planari lunghi da uno a due centimetri e larghi più di due millimetri.

Successivamente, vengono sottoposti a digiuno per tre a sette giorni prima dell'uso. Successivamente, preparare la soluzione di clorotone, un anestetico locale leggero, sciogliendo lo 0,1-0,2% p/v di cleone in acqua pariana. Quindi raffreddare la soluzione su ghiaccio. Per il trapianto di tessuto con un becco di Bunsen, piegare un tubo capillare con diametro interno di 0,75 millimetri a uno o due centimetri dalla fine formando un angolo di 90 gradi per tagliare il tessuto da trapiantare.

Quindi piegare un altro capillare con diametro esterno di 0,7 millimetri a una distanza di uno-due centimetri dall'estremità formando un angolo di 90 gradi, per creare un foro nell'ospite in cui inserire l'innesto. Successivamente, tagliare la carta filtro nera Watman. Numero tre: carta filtro Kimwipe e carta da sigaretta, secondo le dimensioni indicate nel manoscritto allegato.

Successivamente, preparare la soluzione modificata di Holt Fers e la soluzione satura di Caine di Holt Fretter. Raffreddare entrambe a quattro gradi Celsius. Quindi fissare uno strofinaccio di carta Kim piegato a un quadrato di Paraform.

Posizionarlo sulla piastra del refrigeratore Peltier o su un altro dispositivo di raffreddamento sotto un microscopio stereoscopico. Successivamente, saturare la salvietta Kim con soluzione Holt Fretter fredda. Quindi posizionare due rettangoli di carta da filtro nera sulla salvietta Kim.

Ora posizionare un pezzo di carta da filtro Watman numero due in una piastra di Petri. Inumidire la carta da filtro con soluzione di Holt Fretter. Successivamente raffreddare la piastra su ghiaccio per l'irradiazione parziale.

Posizionare un foglio di carta forno più grande in una piastra più grande, in modo simile al trapianto di tessuti. Inumidire la carta da filtro con soluzione di Holt Fretter. Successivamente raffreddare la piastra su ghiaccio.

In questo procedimento, riempire una piastra di Petri con soluzione di cleone fredda. Pipettare le planarie nella piastra per il trapianto. Anestetizzare un solo ospite e un solo donatore alla volta.

Per l'irradiazione parziale, molti animali possono essere anestetizzati contemporaneamente. Quindi lasciare che i paria si immergano nella soluzione di cleone per cinque-dieci minuti fino a quando non diventano immobili. Risciacquare i paria trasferendoli con una pipetta in una piastra riempita con soluzione Holt Fretter fredda.

In seguito, immobilizzare l'area plin pipettandola su carta filtro nera saturata con soluzione di Holt fretter fredda. Quindi orientarla con il lato ventrale verso il basso utilizzando una coppia di pinze. A questo punto, posizionare una piastra di Petri fredda preparata in precedenza all'interno di un contenitore con ghiaccio, che dovrà essere inserita in un irradiatore a raggi X posizionato sopra.

Sistemare la zona plin anestetizzata in una piastra di Petri spostando i fogli di carta filtro nera. Successivamente trasferirla sul dispositivo irradiatore a raggi X, posizionando il contenitore del ghiaccio in modo da ridurre al minimo la distanza tra il tubo catodico e la paria. In questo modo si massimizza la velocità di dose efficace.

Quindi posizionare i ripari di piombo tra il paria e il tubo catodico per la dose di raggi X. Se si desidera un'ablazione completa delle cellule staminali provenienti da regioni non schermate, somministrare 30 gray o superiore. Immediatamente dopo l'emissione dei raggi X, trasferire il paria in acqua paria refrigerata.

Successivamente, lasciare che l'acqua pariana si riscaldi fino alla temperatura ambiente e che gli animali si stacchino dal foglio di carta filtrante nera. La procedura di irradiazione parziale è ora completata. Per iniziare questa procedura sotto il microscopio stereoscopico, posizionare l'ospite anestetizzato e il donatore plin in aree separate su filtri rettangolari neri appoggiati sul fazzoletto di carta Kim, precedentemente raffreddato sulla piastra Peltier o sul refrigeratore.

Utilizzare un tubo capillare con diametro interno di 0,75 mm per prelevare il tassello dal donatore. Quindi utilizzare un paio di pinzette per posizionarlo su una zona periferica dell'ospite. Successivamente, utilizzare un tubo capillare con diametro esterno di 0,7 mm per rimuovere un tassello dall'ospite.

Posizionare successivamente l'innesto nel foro. Trasferire l'ospite trapiantato sulla carta filtrante nera rettangolare nella piastra di Petri preparata in precedenza. Inumidire un pezzo di carta da rotolamento con soluzione di Holt Fretter satura di Caine.

Quindi posizionarlo sopra l'ospite trapiantato. Successivamente, inumidire quattro pezzi di carta filtrante contenente soluzione di Holt Fretter satura e, nel caso in cui l'ospite trapiantato si secchi, inumidire quattro tamponi di carta Kim Wipe tagliata contenente soluzione di Holt Fretter satura. Disporli sopra le carte filtranti.

Dopo di ciò, chiudere il coperchio. Posizionare la piastra di Petri sul ghiaccio. Successivamente, trasferire il parian donatore nell'acqua parian per il recupero e la rigenerazione.

Una volta completati tutti i trapianti, collocare il parian trapiantato in un incubatore a 10 gradi Celsius per tutta la notte. La mattina successiva, trasferirlo in una capsula di Petri riempita con acqua di parian. Lasciare che il parian si stacchi autonomamente dalla carta filtro oppure rimuoverlo delicatamente con pinzette e sostituire l'acqua di parian ogni due o tre giorni successivi.

L'ibridazione in situ con marcatura dei fori nel parassita irradiato, ma completamente schermato e fissato tre giorni dopo l'irradiazione, mostra una distribuzione delle cellule staminali indistinguibile da quella del parassita di tipo selvatico. D'altra parte, nel parassita parzialmente schermato, con le regioni anteriore e posteriore esposte, le cellule staminali sembrano essere eliminate nelle regioni non schermate. Qui vengono mostrate le viste dorsale e ventrale di un parassita sottoposto con successo a trapianto.

Tre giorni dopo il trapianto, l'innesto è chiaramente visibile su entrambe le superfici dorsale e ventrale ed è circondato da un tessuto caratteristico non pigmentato all'interfaccia tra innesto e ospite. Tuttavia, il trapianto non riuscito non mostra tessuto innestato visibile nel sito di trapianto. L'ibridazione in situ su preparati interi ha rivelato la presenza di cellule staminali solo in corrispondenza o intorno alla posizione dell'innesto, indicando il successo del trapianto una volta acquisita padronanza della tecnica.

I trapianti possono essere eseguiti in appena cinque minuti ciascuno. Con tassi di successo che si avvicinano al 90-100% e l'irradiazione parziale può essere notevolmente aumentata. A condizione che l'area del campo del tuo irradiatore sia sufficientemente ampia.