Personalizzazione di Aspergillus niger Morfologia attraverso l'aggiunta di talco micro particelle

Questo metodo genera e caratterizza strutture morfologiche dipendenti da microparticelle di funghi filamentosi, *Aspergillus niger*, al fine di correlare la morfologia fungina con la produttività. Coltivare *A. niger* in presenza o assenza di microparticelle in un biorreattore agitato da tre litri per 72 ore per calcolare la produttività specifica. Prelevare campioni in punti temporali definiti e determinare la biomassa, il peso secco e l'attività della fruttofosfato sintasi.

Dopo 72 ore, esaminare la morfologia fungina mediante microscopia e caratterizzarla tramite analisi dell'immagine digitale. Quindi combinare i parametri rilevanti dell'analisi delle immagini in un numero morfologico che è matematicamente correlato alla produttività specifica. In definitiva, questo metodo può generare con precisione e caratterizzare in modo completo la morfologia di Aspergillus niger per una migliore comprensione della morfogenesi dei microrganismi filamentosi.

Aspergillus niger è un importante cavallo da lavoro industriale nella biotecnologia da molti decenni. Una delle caratteristiche più affascinanti e spesso difficili da controllare degli aspergilli, di niger e delle specie correlate, è la loro complessa morfologia, che varia da pellet sferici densi a miceli viscosi a seconda delle condizioni di coltura. Il principale vantaggio del nostro procedimento è che, grazie all'aggiunta di microparticelle, siamo ora in grado di modulare la morfologia fungina in modo specifico rispetto alle esigenze del processo.

Fino ad ora, non è stato descritto alcun altro metodo per una personalizzazione della morfologia fungina di questo tipo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali riguardo alla coltivazione di microrganismi filamentosi. Poiché per l'applicazione industriale è fondamentale controllare la morfologia fungina e anche saper distinguere tra una morfologia fungina ad alta e bassa produttività.

Il nostro protocollo fornisce i mezzi per una personalizzazione e caratterizzazione desiderabili della morfologia fungina. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla morfologia di Aspergillus niger, può essere applicato anche ad altri microrganismi filamentosi come ceppi di Penicillium o Strepto. Impostare quattro bioreattori per colture sterili come descritto nel protocollo allegato.

Testo basato sull'aggiunta di microparticelle, coltivare Aspergillus niger con morfologia diversa. Dopo 72 ore trasferire 50 millilitri. Campioni di brodo di coltura in un tubo Falcon.

Prelevare campioni di biomassa almeno in duplicato dopo l'essiccamento nel desiccante; pesare un filtro di cellulosa con bilance microanalitiche. Posizionare il filtro in un imbuto di Buchner collegato a una pompa a vuoto ad acqua ed effettuare la filtrazione di 10 millilitri di campione seguiti da 10 millilitri di acqua deionizzata per rimuovere i composti del mezzo dalla biomassa. Pieghire il filtro una volta al centro.

Posizionarlo in una capsula di Petri di vetro e in un essiccatore a scomparti fino a raggiungere costanza di peso. Trasferire il filtro in un essiccatore e lasciarlo raffreddare. Quindi misurare il peso.

Calcolare il peso secco della biomassa per litro mediante il calcolo della differenza di peso dei filtri e successiva divisione per il volume del campione, per i saggi enzimatici della glucosio ossidasi e della perossidasi. Conservare i campioni sul ghiaccio utilizzando una siringa, 1,5 millilitri. Sospendere la coltura attraverso un filtro in acetato di cellulosa in un tubo da reazione per eseguire il saggio beta frutto SASE.

Con attenzione meticolosa, garantiamo il successo utilizzando due campioni in triplice replicazione per una robustezza statistica. Per avviare il saggio, aggiungere 20 microlitri di campione nel tubo da prova; come controllo della scissione del saccarosio in glucosio dipendente da pH e temperatura, utilizzare 20 microlitri di acqua deionizzata al posto di 20 microlitri di campione. Inoltre, per ogni campione, preparare un controllo negativo per il glucosio residuo nel brodo di coltura mediante saggio.

20 microlitri di campione inattivato termicamente. Per avviare la reazione da saccarosio a glucosio, aggiungere 200 microlitri di soluzione di saccarosio 1,65 M. A pH 5,4, aggiungere 20 microlitri di campione e incubare tutti i tubi di reazione in un blocco riscaldante a 40 °C per 20 minuti. Arrestare la reazione riscaldando a 95 °C per 10 minuti dopo aver raffreddato i tubi in ghiaccio.

Centrifugare i campioni se necessario, diluire i campioni per il saggio in modo che l'assorbanza misurata rientri nel range calibrato. Aggiungere ora, per ogni reazione, due microlitri di campione in una piastra micrometrica. Eseguire le misurazioni dei campioni in triplicato.

Preparare inoltre una curva standard con 10 soluzioni di glucosio comprese tra un millimolare e 15 millimolari. Per la calibrazione del punto zero, utilizzare due microlitri di acqua deionizzata. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di soluzione reattiva a ciascuna.

Incubare bene per 10 minuti a temperatura ambiente. Misurare l'assorbanza a 450 nanometri utilizzando un lettore per micropiastre 96 pozzetti Sunrise e il software di acquisizione dati Magellan. Aprire il grafico dei risultati con un foglio di calcolo e costruire una curva standard di calibrazione.

Calcolare l'attività per ogni campione. Quindi calcolare l'attività della beta fruttosidasi sottraendo i valori del controllo negativo appropriato dall'attività del campione. Infine, calcolare la produttività specifica tenendo conto del peso secco della biomassa e dell'attività della beta fruttosidasi.

Posizionare tre millilitri di sospensione culturale in una piastra di Petri di plastica e diluire con soluzione fisiologica di cloruro di sodio per separare le strutture morfologiche. La qualità delle immagini microscopiche è di importanza eccezionale. Per l'analisi successiva delle immagini, è necessario prestare particolare attenzione durante il passaggio di diluizione.

Posizionare la piastra di Petri sotto un microscopio dotato di telecamera integrata. Acquisire e salvare circa 100 immagini delle strutture morfologiche per ogni campione, assicurandosi che ogni immagine contenga completamente almeno un oggetto. Procedere allo stesso modo con le piastre contenenti campioni provenienti da reattori diversi, acquisendo nuove immagini ogni volta.

Notare la diversa forma di crescita morfologica dei campioni provenienti da reattori diversi coltivati con quantità differenti di talco aggiunto. Aprire quindi tutte le immagini dello stesso campione nel programma di elaborazione delle immagini Image J. Mediante lo strumento di elaborazione, creare un'immagine binaria.

Convertire le immagini in bianco e nero per applicare il comando a un'intera serie di immagini. Successivamente, utilizzare un codice macro, aprire una delle immagini contenente una barra di scala. Tracciare una linea retta attraverso la barra di scala per determinare il numero di pixel corrispondenti a 2000 micrometri.

Selezionare lo strumento di analisi, impostare la misurazione e scegliere i fattori di forma, ferret, diametro dell'area e perimetro. Utilizzare un codice macro per elaborare una serie di immagini. Aprire ora il foglio elettronico che riporta i risultati dei valori del fattore di forma.

Per ogni immagine, calcolare un numero di morfologia per ciascuna immagine di tutti gli esemplari di un campione. Calcolare il valore medio del numero di morfologia. Utilizzare un programma di grafica e analisi dati per tracciare il numero di morfologia in funzione della produttività specifica.

Stabilire la relazione matematica mediante regressione matematica aggiungendo concentrazioni crescenti di microparticelle di talco. Otto Niger SKAN 10 15. La morfologia cambia da una morfologia a pellet vera a una morfologia dispersa o addirittura mi, poiché la morfologia a pellet è esibita nelle condizioni standard.

È interessante notare che la morfologia miceliale viene indotta aggiungendo al mezzo 10 grammi per litro di microparticelle di talco. Contestualmente, l'attività della beta-fruttofasi aumenta di circa tre volte. L'aggiunta di uno o tre grammi per litro di polvere di talco porta invece a una morfologia dispersa con un'attività fruttosica doppia, utilizzando parametri determinati mediante analisi automatica delle immagini. La morfologia dipendente dalle microparticelle può essere descritta in modo esaustivo mediante la morfologia.

La nota numero, perfettamente rotonda in pellet lisci, in immagini microscopiche appare come cerchi perfetti per tali particelle. Il numero di morfologia ha un valore che si avvicina a uno nelle condizioni standard. La morfologia nel reattore uno mostra un numero di morfologia di circa 0,8.

La morfologia nel reattore quattro con 10 grammi per litro. La polvere di talco presenta un numero di morfologia di circa 0,1. Il numero di morfologia per i reattori due e tre, con concentrazioni di polvere di talco di uno e tre grammi per litro, si colloca tra questi estremi, dimostrando una morfologia dispersa.

Poiché la morfologia dipendente dai microparticelle è strettamente correlata alla produttività delle beta fruttositi, esiste una buona correlazione matematica tra morfologia, numero e produttività dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biotecnologia per approfondire ulteriormente la morfologia fungina e in particolare la sua relazione con la produttività. Seguendo questa procedura di creazione dettagliata di tipi morfologici specifici di funghi, possono essere esplorati altri aspetti importanti della coltivazione di microrganismi filamentosi.

Si sa, ad esempio, che la morfologia miceliale è molto più viscosa rispetto alla morfologia a palo. Di conseguenza, la produttività complessiva del processo risulta compromessa da problemi di purificazione del prodotto desiderato. Il nostro numero di morfologia contribuirà a stabilire modelli riguardanti la coltura, la prototeologia e a migliorare la comprensione generale della morfologia fungina.