Isolamento dei ribosomi Polipeptidi Bound nascenti

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e localizzare i principali siti di pausa traduzionale per un mRNA tradotto in un sistema di traduzione acellulare. Questo viene ottenuto innanzitutto clonando il gene di interesse sotto il controllo di un promotore trascrizionale T7. Successivamente, l'mRNA viene trascritto e purificato.

Successivamente, la traduzione in vitro viene eseguita in presenza di mRNA e aminoacidi radioattivi per marcare la proteina sintetizzata e i polipeptidi nascenti. Infine, i polisomi vengono isolati mediante centrifugazione in gradiente di velocità di sedimentazione e le catene nascenti isolate vengono separate tramite elettroforesi su gel. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano polipeptidi nascenti di diverse lunghezze mediante Tristine SDS page e autoradiografia, indicando così la presenza di siti di pausa lungo l'mRNA di interesse.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai nostri metodi esistenti, come il saggio di protezione del micro nucleo cocal, è che è estremamente semplice, rapida ed efficiente, e permette la determinazione e l'identificazione dei principali siti di traduzione post-trascrizionale lungo qualsiasi MNA in un dato sistema cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune delle domande fondamentali nel campo della traduzione e del ripiegamento proteico traduzionale, come ad esempio in che modo fattori cellulari quali l'uso dei codoni, l'abbondanza di TNA e/o la struttura secondaria dell'mRNA possano influenzare la cinetica della traduzione. Questo metodo potrebbe inoltre migliorare la nostra comprensione delle relazioni tra la cinetica della traduzione e le fasi chiave del percorso di ripiegamento delle proteine durante la traduzione codificata.

L'implicazione di questa tecnica riguarda la comprensione del processo del ripiegamento delle proteine in vivo, che si ritiene avvenga prevalentemente in modo co-traduzionale durante la traduzione sul ribosoma, sebbene lo studio attuale preveda una traduzione libera da cellule della gamma-bicristallina mediante un estratto cellulare disponibile in commercio. Questa tecnica può inoltre essere applicata per identificare gli IDE traduzionali in potenzialmente qualsiasi proteina, utilizzando un estratto competente per la traduzione preparato da qualsiasi fonte cellulare. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontrerà difficoltà in due passaggi chiave del protocollo.

Il primo punto consiste nel determinare il tempo complessivo necessario per eseguire la reazione di traduzione, in modo da garantire che la maggior parte dei polipeptidi nascenti rimanga legata al ribosoma. Il secondo punto riguarda la scelta di un sistema di gel elettroforetico appropriato per risolvere la maggior parte dei polipeptidi nascenti; la scelta del sistema di gel dipende dalle dimensioni della proteina in studio. Abbiamo concepito per la prima volta questa metodica quando, negli anni ottanta, decidemmo di analizzare la cinetica traduzionale delle molecole di globina in relazione al modello proposto per il ripiegamento co-traduzionale della globina.

La non uniformità della traduzione delle globine fu osservata per la prima volta da PRO e Maurice nel 1974, utilizzando la cromatografia ad esclusione dimensionale CLO delle catene NAS e delle globine. Tuttavia, la loro analisi non possedeva la precisione desiderata; Pro e altri hanno osservato quattro principali siti di arresto della traduzione durante il processo traduttivo della globina. Successivamente, la nostra analisi ha permesso di rivelare circa 10 siti aggiuntivi e di costruire un modello dettagliato del ripiegamento traduzionale della globina. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la tecnica qui descritta prevede l'isolamento dei polisomi e l'analisi del polipeptide nascente mediante gel Tri S Ds page.

Entrambi questi passaggi sono fondamentali per ottenere risultati di alta qualità e riproducibili. La dimostrazione del progel sarà effettuata da uno studente laureato del laboratorio Myelo, Sujata For, per la trascrizione in vitro di RNA messaggero. Si inizia con un gene di interesse che è stato clonato sotto un promotore T7 o SP6; utilizzando un enzima di restrizione appropriato, linearizzare il modello di DNA a valle del codone di stop e/o della fine 3' dell'RNA messaggero.

Un campione della digestione con enzimi di restrizione viene sottoposto a elettroforesi su gel agarosio per verificare che il DNA sia completamente linearizzato. Dopo aver determinato la concentrazione ottimale del template di DNA, utilizzare un kit di trascrizione per sintetizzare in vitro l'RNA messaggero seguendo le istruzioni del produttore. Successivamente, purificare l'mRNA mediante precipitazione con cloruro di litio.

Quindi utilizzare l'elettroforesi su gel di acrilamide o aros per verificare la sua purezza. Preparare una reazione di traduzione in vitro di 100 microlitri in acqua priva di nucleasi aggiungendo una miscela di aminoacidi da un millimolare priva di metionina, 10 unità di inibitore dell'RNA, 20 microcurie di metionina radioattiva 35 s e lisato di reticolociti di coniglio. Successivamente preriscaldare la reazione incubandola a 30 gradi Celsius per cinque minuti.

Quindi aggiungere due microgrammi di mRNA e incubare a 30 gradi Celsius per cinque minuti per arrestare la reazione, quindi porre sul ghiaccio per isolare i polipeptidi nascenti legati ai ribosomi. Sovrapporre la reazione di traduzione su 4,5 millilitri di glicerolo al 30% in HCl pH 7,6 con cloruro di potassio e cloruro di magnesio, utilizzando una centrifuga con rotore TLA 110 a 100.000 ×g per un'ora a gradi Celsius. Successivamente, rimuovere con attenzione il soprannatante, quindi risospendere il pellet polisomale contenente i polipeptidi nascenti in un piccolo volume di tampone tris 1 millimolare, HCl pH 7,6 contenente 0,5 milligrammi per millilitro di ribonucleasi A e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.

Per potenziare l'idrolisi del legame estereo peptidico TRNA, aggiungere idrossido di sodio a una concentrazione finale di 10 millimolari alla reazione e incubare per ulteriori 30 minuti. Risolvere i polipeptidi nascenti mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide in presenza di tris tri SDS, quindi fissare e asciugare i gel. Sottoporre i gel ad autoradiografia, seguita da phospho imaging per la rilevazione dei polipeptidi nascenti.

Le alterazioni del movimento del ribosoma indotte da cambiamenti nella popolazione di tRNA dovrebbero portare a modifiche nella distribuzione delle dimensioni dei polipeptidi nascenti che si accumulano durante la traduzione, così come nelle loro intensità relative, che riflettono la durata della pausa in questo punto. I polipeptidi nascenti della proteina cristallina gamma B sono stati isolati e separati mediante elettroforesi SDS-PAGE Tristine. Le diverse lunghezze e intensità dei polipeptidi nei sistemi RRL ed e coli indicano che il movimento dei ribosomi lungo l'mRNA in questi due sistemi segue cinetiche di traduzione differenti.

Ad esempio, osservare la marcata banda di 17,7 kilodalton nel lisato di e coli, assente nel sistema lisato di reticolociti di coniglio. La gamma B cristallina contiene codoni di arginina in tandem, frequenti nei sistemi mammiferi, ma noti per essere estremamente rari e lentamente tradotti in e coli, suggerendo che questa banda sia causata dall'arresto del ribosoma. A questi codoni rari in tandem, come mostrato qui.

Nessuna banda può essere osservata in assenza di mRNA e il trattamento con puromicina rimuove la maggior parte delle catene nascenti dai polisomi. Inoltre, un trattamento prolungato con puromicina elimina tutte le catene nascenti, confermando che i prodotti polipeptidici osservati sono catene nascenti associate ai ribosomi e non proteine mitocondriali di membrana (MRPs) che co-sedimentano con i polisomi. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due giorni. La durata della procedura dipende principalmente dalla durata della centrifugazione e dell'elettroforesi su gel dei peptidi nascenti.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è fondamentale arrestare immediatamente la reazione di traduzione al termine del periodo di incubazione. Per evitare il rilascio del polipeptide nascente dal ribosoma, è ovviamente essenziale evitare le RNA in ogni fase. Una contaminazione da RNA potrebbe compromettere l'efficienza di traduzione dell'estratto e causare il rilascio del polipeptide nascente dal ribosoma seguendo questa procedura.

Altri obiettivi, come ad esempio gli effetti delle proteine leganti l'mRNA sull'efficienza del movimento del ribosoma su un determinato messaggio, possono essere testati anche successivamente allo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del ripiegamento proteico per esplorare il ruolo della traduzione determinato dalla presenza di codoni rari nel ripiegamento proteico traduzionale. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per verificare il ruolo delle sostituzioni di lisina sul movimento del ribosoma lungo un messaggio e sul ripiegamento proteico traduzionale.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare i siti attivi nella traduzione dell'mRNA isolando i polipeptidi nascenti legati al ribosoma. Non dimenticare che lavorare con isotopi radioattivi e amminoacidi marcati, come ad esempio la metionina A 35, richiede precauzioni particolari e deve essere sempre tenuto in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.