Purificazione per affinità di Complessi virus influenzali ribonucleoproteina dalla cromatina delle cellule infettate

Lyco a filamento negativo, virus a RNA. Il genoma dei virus dell'influenza è impacchettato sotto forma di complessi ribonucleoproteici virali, o VR nps, nei quali il genoma a singolo filamento è incapsulato dalla proteina nucleare ed associato al complesso della polimerasi costituito dalle subunità PA, PB uno e PB due. Per purificare complessi integri da cellule di mammifero infette, le cellule HeLa vengono incubate con un virus dell'influenza ricombinante marcato con strept.

Una volta che il virus entra nelle cellule, l'RNA virale viene sintetizzato nei nuclei dopo l'infezione; quindi, le cellule vengono lisate utilizzando un detergente e frazionate in frazioni citoplasmatica, nucleare e della cromatina mediante centrifugazione e un protocollo di frazionamento della cromatina basato su sali. Infine, i VRP marcati con streptavidina vengono purificati per affinità da ciascuna frazione. L'analisi della composizione proteica e dell'RNA dei VRP purificati mediante colorazione argentica dimostra che, utilizzando questo protocollo, anche i VRP strettamente legati alla cromatina possono essere isolati in forma integra. Uno dei principali vantaggi del nostro protocollo, rispetto ai metodi standard di purificazione per affinità dei complessi ribonucleoproteici del virus dell'influenza, è che grazie al nostro metodo è possibile purificare i VRP dalla cromatina delle cellule infette, che è nota essere il sito della sintesi dell'mRNA del virus dell'influenza.

Pertanto, il nostro metodo potrebbe essere utilizzato per rispondere a domande riguardanti la regolazione della replicazione e della trascrizione virale, ad esempio quali fattori virali o cellulari, ma anche quali modifiche post-traduzionali siano necessarie, per esempio, per la sintesi dell'mRNA virale o anche per la sintesi dell'RNA genomico virale. I ricercatori alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare alcune difficoltà, poiché la frazionatura subnucleare è molto sensibile alle condizioni biochimiche e può variare notevolmente tra diverse linee cellulari. Iniziare questo protocollo con cellule sane infettate con il virus dell'influenza RWSN PB2 strep, che presenta un tag strep fuso geneticamente al termine C della subunità PB2, a una multiplicità di infezione di tre.

Lavare le cellule una volta con PBS freddo, quindi aggiungere 12 millilitri di PBS freddo e rimuoverle dalla piastra. Utilizzando un raschietto di gomma, trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri e formare il pellet mediante centrifugazione.

L'aspetto più complesso di questa procedura è il protocollo di frazionamento cellulare. I nuclei cellulari sono molto sensibili alle procedure di omogeneizzazione e di miscelazione, e se eseguite in modo errato, possono facilmente compromettere un estratto di cromatina. È quindi molto importante seguire non solo le tecniche di omogeneizzazione, ma anche le indicazioni generali per la manipolazione dei lisati, come mostrato in questo video.

Dopo la centrifugazione ed eliminazione del soprannatante, sospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di tampone di saccarosio freddo. Applicare una punta da 200 microlitri a una pipetta serologica in plastica da 10 millilitri ed eseguire il passaggio delle cellule attraverso la punta per rompere gli aggregati cellulari. Incubare la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti.

Invertire periodicamente delicatamente le provette per risospendere le cellule. Successivamente, aggiungere NP-40 a una concentrazione finale dello 0,5% e vortexare ad alta velocità per 15 secondi; centrifugare immediatamente per 10 minuti a 3.500 × g a 4 gradi Celsius in una centrifuga da banco. Al termine della centrifugazione, rimuovere il sopranatante e trasferirlo in una provetta conica da 15 millilitri.

Conservare il sopranatante a quattro gradi Celsius. Questa è una frazione citoplasmatica. Il pellet dovrebbe essere più piccolo e più chiaro rispetto al pellet cellulare originale, come mostrato qui.

Se il protocollo verrà completato in un momento successivo, conservare il pellet cellulare a quattro gradi Celsius. In caso contrario, procedere lavando il pellet in cinque millilitri di soluzione tamponata fredda di saccarosio e centrifugando come in precedenza. Al termine della centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere il pellet, che contiene i nuclei, in 1,5 millilitri di tampone freddo per l'estrazione del plasma nucleare.

Trasferire il pellet risospeso in un omogeneizzatore in vetro da quattro millilitri, raffreddato, dotato di pestello ben aderente ed omogeneizzare i nuclei con 20 movimenti. Evitando la formazione di schiuma, la resistenza dovrebbe aumentare dopo circa 10 movimenti. Per confermare un'omogeneizzazione efficiente, esaminare il campione al microscopio a contrasto di fase.

I nuclei non dovrebbero più essere rotondi, ma presentare forme irregolari e apparire come se fossero esplosi. Una volta che i nuclei sono stati omogeneizzati, trasferirli in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro. Incubare l'omogenato su un rotatore a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi centrifugare a 16.000 ×g in una microcentrifuga per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, trasferire il soprannuante, ovvero la frazione nucleoplasmatica, in un tubo da 1,5 millilitri e conservarlo a quattro gradi Celsius. Quindi sospendere il pellet in 1,5 millilitri di tampone di digestione preriscaldato a 37 gradi Celsius.

Quindi, incubare la frazione per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 42 microlitri di cloruro di sodio cinque molar per portare la concentrazione finale di cloruro di sodio a 150 millimolar, quindi incubare per 20 minuti sul ghiaccio. Centrifugare a 16.000 ×g in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il sopernatante e conservarlo a quattro gradi Celsius. Questa è la frazione CH una 50. Risospendere il pellet in 1,5 millilitri di tampone freddo ad alto contenuto salino e incubare per 20 minuti sul ghiaccio.

Centrifugare a 16.000 ×g in una microcentrifuga a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Al termine della centrifugazione, rimuovere il sopranatante e conservarlo a quattro gradi Celsius. Questa è la frazione CH 500.

Estrarre le frazioni conservate durante il protocollo di frazionamento e posizionarle sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere alla frazione citoplasmatica 300 microlitri di cloruro di sodio cinque molar. Poi trasferire 100 microlitri di perle di streptavidina T in Sphero compattate per frazione in un tubo conico da 15 millilitri.

Aggiungere 10 volumi di buffer di lavaggio con streptavidina alle perle. Capovolgere il tubo per mescolare e centrifugare per cinque minuti a 1000 ×g in una centrifuga da banco, scartare il soprannatante.

Ripetere il lavaggio con il buffer due volte, quindi risospendere il pellet in un volume uguale di buffer di lavaggio con streptavidina; aggiungere 200 microlitri di streptavidina attiva in sospensione di perle a ciascuna frazione. Ruotare i tubi per un'ora a quattro gradi Celsius. Successivamente, centrifugare i tubi per un minuto a 1000 ×g a quattro gradi Celsius, quindi scartare il soprannuante.

Quindi aggiungere un millilitro di buffer di lavaggio alle perle che sono state incubate con la frazione citoplasmatica in un tubo da 15 millilitri. Aggiungere il buffer di lavaggio e trasferire le perle in un tubo da 1,5 millilitri. Lavare le perle per un minuto, quindi centrifugare i tubi per un minuto a 1000 ×g a quattro gradi Celsius.

Ripetere due volte dopo l'ultimo passaggio di lavaggio. Rimuovere ogni traccia del tampone di lavaggio utilizzando una punta di pipetta piatta. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione e mescolare delicatamente, quindi posizionare i tubi sul ghiaccio per 15 minuti.

Durante l'incubazione, mescolare occasionalmente le perle picchiettando delicatamente il fondo dei tubi. Dopo 15 minuti, centrifugare per un minuto a 1000 ×g a quattro gradi Celsius. Raccogliere la sospensione contenente i VRP eluiti con tag strep.

Egli, le nostre cellule sono state infettate per nove ore con il ceppo virale dell'influenza WSN e i lisati frazionati sono stati analizzati mediante western blotting come mostrato qui. L'isolamento delicato del nucleo estrae in modo efficiente proteine citoplasmatiche come la tubulina, evitando al contempo il rilascio di abbondanti proteine nucleari. Si noti che la frazione cromatinica estratta con bassa concentrazione di sale è arricchita in proteine importanti per la trascrizione.

Mentre la frazione ad alto contenuto salino contiene principalmente nucleosomi, per determinare la composizione proteica della frazione citoplasmatica eluita, i V NPS ottenuti dalle cellule R infettate per nove ore con virus non marcato, RWSN o RWSN PB due strep, sono stati analizzati mediante colorazione argentica, come mostrato per un eluato citoplasmatico. In questo caso, si osserva un elevato rapporto tra NP e PA PB uno, PB due, evidenziato dalla banda principale al di sopra di 55 chilodalton rispetto alle bande comprese tra 95 e 100 chilodalton, suggerendo che la maggior parte del PB due strep viene purificata come parte di un VRNP completamente assemblato, ovvero viene catturata una quantità minima di polimerasi solubile. Per confrontare le rese relative, i VR NPS purificati dopo nove ore di infezione con RWSN PB due strep o RWSN sono stati sottoposti a colorazione argentica, come mostrato in questo gel colorato con argento. I v RMPs possono essere purificati da tutte e quattro le frazioni cellulari dopo nove ore di infezione.

La concentrazione più elevata di vRNP si trova nel plasmo nucleare, anche se porzioni considerevoli possono essere purificate anche dal citoplasma e dalla cromatina. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione delle modalità per purificare elevate rese di complessi ribonucleoproteici intatti del virus dell'influenza dal nucleo di cellule infette. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare tamponi puliti e di evitare di esporre i campioni inutilmente alla temperatura ambiente, in modo da prevenire sia il degrado dell'RNA e delle proteine sia la disassemblazione dei complessi proteici.

E non dimenticare che lavorare con un virus influenzale infettivo può essere pericoloso. Tutti i passaggi devono essere eseguiti sotto una cappa a livello di sicurezza biologica due fino all'aggiunta di NP-40 ai lisati.