Protocollo di raccolta per pancreas umano

L'obiettivo generale di questa procedura è dissezionare il pancreas umano in modo da mantenere l'orientamento anatomico. Questo viene ottenuto rimuovendo il duodeno e la milza dal pancreas, quindi eliminando il tessuto adiposo e i vasi in eccesso dal pancreas. Il secondo passaggio consiste nell'applicare dell'inchiostro blu sulla superficie anteriore e dell'inchiostro nero sulla superficie posteriore.

Successivamente, il pancreas viene diviso in tre regioni. Ogni regione viene quindi tagliata trasversalmente in fette uniformi e posizionata su cassette in paraffina, stampi in OCT oppure ulteriormente tritata e posta in provette. Alla fine, i campioni vengono raccolti da tutte e tre le regioni del pancreas, mantenendo l'orientamento anatomico corretto per analisi future.

Questo metodo può aiutare ad affrontare domande fondamentali nella ricerca sul diabete di tipo 1, come i meccanismi alla base della perdita della massa o della funzione delle cellule beta, e la natura dell'attacco delle cellule immunitarie. La dimostrazione visiva della metodica di elaborazione del pancreas è fondamentale poiché il mantenimento dell'orientamento in vivo del pancreas richiede una particolare attenzione ai dettagli. La procedura sarà dimostrata da Linda Snyder, tecnologa istologa, e da Emily Montgomery, scienziata biologa, nel mio laboratorio.

Cominciare preparando tutti i materiali necessari per la procedura. Etichettare innanzitutto le cassetine che conterranno i blocchi di paraffina con un identificativo del donatore, il tipo di campione, il numero dell'aliquota e qualsiasi altra informazione aggiuntiva. Successivamente, etichettare gli stampi in OCT nello stesso modo.

Tagliare abbastanza pezzi di carta d'alluminio per avvolgere ciascun blocco di OCT e metterli da parte per un uso successivo. Preparare tutte le provette necessarie per conservare i campioni freschi e congelati. Aggiungere successivamente l'RNA e il mezzo RPMI quando appropriato.

Successivamente, preparare le aree di lavoro, posizionando le tavole per dissezione, gli strumenti sterilizzati e tutte le altre forniture necessarie per la procedura sia all'interno di una cappa a sicurezza biologica sia su un piano di lavoro. Disporre tutte le cassettes e gli stampi in OCT in ordine di utilizzo nelle vicinanze. Preparare un bagno di congelamento aggiungendo isopentano sufficiente a coprire la CO₂ solida sul fondo di un contenitore in polistirolo.

Per iniziare la dissezione, rimuovere il duodeno e la milza. Iniziare a separare il duodeno dal pancreas da un'estremità e continuare fino a quando non saranno completamente staccati. La milza è legata in modo lasso e può essere facilmente rimossa dal tessuto adiposo e dal pancreas.

Successivamente, pulire il pancreas dai vasi adiposi e dai nervi accessori utilizzando una combinazione di dissezione ottusa e affilata. Mettere da parte il tessuto adiposo e i linfonodi per essere lavorati successivamente. Una volta pulito, posizionare il pancreas su un tavolo anatomico ricoperto con carta assorbente.

Mantenere la corretta orientazione del pancreas è l'aspetto più difficile di questa procedura. Per garantire il successo, le superfici anteriore e posteriore vengono colorate con inchiostri di colore diverso. Immergere un applicatore di cotone in inchiostro blu, stendere l'inchiostro sulla superficie anteriore del pancreas e asciugare l'eccesso.

Successivamente, immergere un nuovo applicatore nell'inchiostro nero e stenderlo sulla superficie posteriore del pancreas. Riportare il pancreas nella sua normale orientazione. Con la superficie anteriore rivolta verso l'alto, il pancreas è ora pronto per essere diviso in tre sezioni.

Per prima cosa, recidere la giunzione tra la testa e il corpo. Successivamente, dividere la porzione rimanente in parti approssimativamente uguali per separare il corpo dalla coda, registrando il peso di ciascuna regione del pancreas. Iniziare dalla sezione della testa.

Dividere ogni regione in sezioni di circa 0,5 centimetri effettuando tagli trasversali, simili al taglio di una pagnotta di pane. Dopo aver affettato ogni regione del pancreas, rimuovere l'ultima sezione della regione della testa, ovvero la sezione di giunzione tra testa e corpo, e posizionarla su un'apposita tavoletta per dissezioni. Triturare questa sezione in piccoli pezzi e suddividere i pezzi in parti uguali tra crioprovetta etichettate con e senza RNA.

In seguito, le provette vengono congelate. Seguire le procedure standard. Ripetere questa procedura per la sezione di giunzione tra corpo e coda.

Dopo aver raccolto i campioni tritati, inclinare tutte le sezioni trasversali verso destra. Verranno rimosse sezioni alternate di ciascuna regione. Per i blocchi in paraffina e OCT, rimuovere la prima sezione per il bloccaggio in paraffina.

Se una sezione è troppo grande, tagliarla a metà. Etichettare le cassetta come A e B. Se il pezzo è ancora troppo grande, tagliare ogni sezione perpendicolarmente al taglio precedente, quindi etichettare le cassetta da A a D in senso orario. Come mostrato qui, posizionare la cassetta in modo che l'etichetta sia a sinistra.

Successivamente, posizionare il tessuto nella cassetta e chiudere il coperchio. Trasferire la cassetta in un contenitore contenente formalina neutra tamponata. Numerare il blocco in ordine sequenziale all'interno di ogni regione, iniziando dalla sezione più mediale per i blocchi OCT.

Versare un sottile strato di mezzo OCT in uno stampo pre-etichettato. Prima di introdurre il tessuto, ricoprirlo con mezzo OCT e congelare rapidamente il campione per un uso successivo, tornando poi al tessuto che era stato messo da parte in precedenza. Isolare i linfonodi pancreatici rimuovendo il grasso e i tessuti connettivi circostanti la capsula del linfonodo. Posizionare i linfonodi in una piastra sterile contenente DMEF e tritare i linfonodi di grandi dimensioni in pezzi non superiori a 0,5 centimetri.

Dopo aver isolato i linfonodi pancreatici, dividere il tessuto tra le provette e le cassetine preparate per ulteriori lavorazioni. Al termine dei linfonodi, il milza viene tritata e conservata in modo analogo. Per processare il duodeno, utilizzare un tampone di garza inumidita per pulire la mucosa da muco, staccare la mucosa e quindi tagliarla in sezioni.

Dividere i campioni di mucosa come mostrato in precedenza. Utilizzando questo procedimento, vengono raccolti campioni rappresentativi di ciascuna regione del pancreas, come mostrato qui. I pesi delle regioni della testa, del corpo e della coda erano approssimativamente uguali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come processare un pancreas umano in diversi tipi di campioni, in particolare della capacità di mantenere l'orientamento, nonché di come isolare i linfonodi dal tessuto adiposo peripancreatico.