Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

In questo video, descriviamo un procedimento efficiente in termini di tempo e costi per l'espressione di proteine secretorie da cellule HEC 293T modificate. Inizialmente, viene preparata una coltura di cellule HEC 293T al 40% di confluenza in una piastra a sei pozzetti. Successivamente, si prepara una miscela di trasfezione diluendo il reagente GeneJuice e i plasmidi di prova in mezzo privo di siero.

La miscela di trasfezione viene depositata sulle cellule, che vengono quindi incubate a 37 gradi Celsius per consentire l'espressione della proteina. La rilevazione della proteina nell'agente sopran è possibile mediante blotting western. Una volta identificato un costrutto idoneo, la procedura può essere ampliata utilizzando fabbriche cellulari a 10 strati.

Le cellule vengono trasfettate utilizzando PEI come reagente di trasfezione. Le proteine possono essere raccolte dai sopranatanti di coltura mediante filtrazione tangenziale seguita da cromatografia ad affinità. In definitiva, questa piattaforma consente l'espressione di un'ampia gamma di macromolecole in quantità dell'ordine del milligrammo.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'espressione in cellule di insetto basata sul virus balo, è che un elevato numero di costrutti può essere analizzato e amplificato per l'espressione, ottenendo risultati in sole tre settimane. A illustrare questa procedura saranno Hello Aiden per Shada Zini e Jonathan Cook, tre studenti laureati del mio laboratorio. Iniziare seminando 250.000 cellule HEC 2 9 3 T per pozzetto in un volume di un millilitro in una piastra a sei pozzetti; aggiungere un millilitro per pozzetto di DMEM integrato con FBS al 10% e pentre, quindi agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule in modo uniforme.

Quindi incubare le cellule durante la notte in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% a 37 gradi Celsius. Una volta che le cellule raggiungono una confluenza di circa il 40%, sostituire il SUP natum con due millilitri di mezzo fresco per preparare la miscela di trasfezione. Per prima cosa, aliquotare 90 microlitri di DMEM privo di siero in una provetta eppendorf.

Quindi aggiungere tre microlitri di gene juice, il reagente di trasfezione, mescolare delicatamente il contenuto del tubo e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre di 100 nanogrammi per microlitro del plasmide purificato con mini prep, DNA, da trasfettare.

Mescolare il contenuto del tubo e lasciarlo a temperatura ambiente per 15 minuti. Per eseguire la trasfezione, aggiungere la miscela sulle cellule HEC 2 9 3 T. Goccia a goccia, agitare delicatamente la piastra per distribuire in modo uniforme la miscela di trasfezione.

Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius. 24 ore dopo, aggiungere un millilitro di mezzo fresco in ogni pozzetto e incubare per ulteriori 48 ore. Tre giorni dopo la trasfezione, raccogliere il sopernatante e rilevare i livelli di espressione della proteina di interesse mediante western blot.

Una volta identificato un costrutto appropriato, la procedura di trasfezione può essere ampliata. Utilizzando dei biorattori a 10 strati, riempire un biorattore con 1,2 litri di DMEM integrato con il 5% di FBS. Quindi aggiungere 200 milioni di cellule HEC 2 9 3 T, distribuendo le cellule uniformemente su tutti gli strati.

Quattro fiaschi da coltura cellulare quadrati da 225 centimetri, cresciuti fino a confluenza al 100%, contengono circa 200 milioni di cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Preparare la miscela di trasfezione in un fiasco T75 diluendo 840 microgrammi di DNA in 84 millilitri di PBS sterile 1x.

Aggiungere 2,5 millilitri di una soluzione di polietileneimmina (PEI) da un milligrammo per millilitro e incubare la miscela a temperatura ambiente per 15 minuti. La soluzione dovrebbe diventare torbida. Successivamente, versare lentamente la miscela di trasfezione nel contenitore per colture cellulari e distribuirla accuratamente.

Strati complessivi. Aggiungere acido valproico a una concentrazione finale di quattro millimolari. Questo aumenterà i rendimenti di espressione una volta aggiunta la miscela di trasfezione.

Incubare la coltura a 37 gradi Celsius per quattro giorni per consentire l'espressione proteica. Raccogliere il mezzo quattro giorni dopo la trasfezione e pulire immediatamente il cell factory per il riutilizzo; centrifugare il mezzo raccolto a 6.000 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius e filtrarlo attraverso un apparato di filtrazione a vuoto con filtro sterile da 0,22 micron per rimuovere qualsiasi materiale particolato. Successivamente, utilizzare il sistema di filtrazione tangenziale Centra Mate per concentrare il sopranatante fino a 75 millilitri.

Una volta concentrato il surnatante, la proteina di interesse può essere purificata mediante cromatografia ad affinità. In questo esperimento, abbiamo purificato le subunità marcate con HA del dominio extracellulare dei recettori umani AAL2 utilizzando il sistema su larga scala descritto qui, seguito da cromatografia ad alta affinità con anti-HA. Come mostrato in questa analisi SDS-PAGE colorata con Coomassie.

I domini extracellulari delle subunità alfa e gamma del recettore per l'interleuchina due migrano con pesi molecolari rispettivamente di 40 chilodalton e 46 chilodalton. L'eterogeneità dei glicani EnLink presenti su IL-2R alfa e IL-2R gamma ha causato un allargamento delle bande nel gel SDS-PAGE. La banda con peso molecolare più elevato rappresenta BSA contaminante.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come esprimere proteine da colture cellulari umane utilizzando fabbriche cellulari a 10 strati. Non dimenticare che le cellule HC 2 93 T sono considerate pericolose per la biosicurezza e devono essere manipolate a livello di biosicurezza 2. Indossa sempre idonei indumenti di protezione personale e le superfici devono essere disinfettate secondo le linee guida istituzionali e governative.