Cella di misura Kinetics progressione del ciclo con la marcatura metabolica e citometria a flusso

L'obiettivo generale della seguente procedura è misurare la cinetica e il progresso del ciclo cellulare. Innanzitutto, le cellule vengono marcate con una pulsazione seguita da chase utilizzando romo, deossiuridina o BRDU, che si incorpora nel DNA cellulare al posto della timidina. Successivamente, le cellule vengono immunoetichettate con anticorpi diretti contro BRDU e analizzate mediante citometria a flusso immediatamente dopo la colorazione.

Solo le cellule in fase S vengono marcate, poiché le cellule marcate procedono nel ciclo cellulare fino alla fase G2. Vengono rilevate come aventi un contenuto di DNA pari a 4N dopo la mitosi. Il contenuto di DNA viene ridotto a 2N. Pertanto, l'analisi dei profili di fluorescenza generati dalla citometria a flusso può essere utilizzata per determinare la cinetica del progresso nel ciclo cellulare.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri protocolli che utilizzano sostanze chimiche per la sincronizzazione cellulare è l'assenza di perturbazioni fisiologiche che potrebbero influenzare inavvertitamente il meccanismo della divisione cellulare. Abbiamo utilizzato per la prima volta questo metodo quando i nostri tentativi di studiare la velocità di progressione del ciclo cellulare mediante sincronizzazione chimica ci hanno fornito risultati inattesi, interferendo con la nostra analisi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare.

Ad esempio, qual è la base dei tassi di crescita differenziali tra diversi tipi cellulari? Iniziare questo protocollo con un'etichettatura pulse-chase delle cellule con BRDU per fare ciò. Etichettare inizialmente una piastra da 10 centimetri per ciascun punto temporale più una per ciascuno dei seguenti controlli.

Solo BRDU, solo PI, negativo per BRDU, negativo per PI; seminare ogni piastra con cinque volte 10 alla quinta cellule MCF7 in DMEM integrato. Incubare le piastre per 24-48 ore per consentire alle cellule di riprendersi e aderire. Quando le cellule raggiungono una confluenza del 60%, sostituire il mezzo con DMEM fresco contenente 10 micromolari.

Incubare le cellule con BRDU per un'ora a 37 gradi Celsius e 5% CO2 per consentire l'incorporazione del BRDU nel DNA. Assicurarsi di lasciare una piastra non trattata da utilizzare come controllo negativo o punto zero dopo un'ora. Rimuovere il mezzo di marcatura a impulsi e risciacquare brevemente le cellule con PBS per i punti temporali compresi tra due e otto ore.

Aggiungere mezzo di crescita fresco e riposizionare le piastre nell'incubatore. Successivamente, raccogliere immediatamente le piastre relative ai tempi zero e un'ora come descritto nella sezione seguente. Per raccogliere le cellule, aspirare il mezzo e risciacquare la piastra.

Una volta con PBS, quindi si aggiunge la tripsina per staccare le cellule dalla piastra e raccoglierle in DMEM, centrifugando a 390 ×g per cinque minuti. Eliminare il soprannatante. Successivamente, lavare le cellule in uno a cinque millilitri di PBS freddo su ghiaccio, centrifugando a 390 ×g per cinque minuti; dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in cento microlitri di ghiaccio.

PBS freddo contenente 1% di FBS. L'FBS aiuta a prevenire l'aggregazione cellulare. Uno degli aspetti più importanti di questa procedura è assicurarsi di ottenere una sospensione monocellulare dalle cellule raccolte.

Per i fatti. Per ottenere questo, è possibile aggiungere le cellule direttamente alla goccia di etanolo, goccia dopo goccia. Questo passaggio è fondamentale. Per fissare le cellule, utilizzare la pipetta per aggiungere le cellule, goccia a goccia, a cinque millilitri di ghiaccio secco.

Etilene al 70% in un tubo conico da 15 millilitri. Incubare le cellule sul ghiaccio per 30 minuti oppure conservarle a quattro gradi Celsius durante la notte. Questo è un passaggio ideale in cui interrompere la raccolta dei campioni dai diversi punti temporali; i campioni possono essere lasciati nell'etanolo per diversi giorni, consentendo di processarli contemporaneamente nei passaggi successivi del protocollo per la colorazione con BRDU e ioduro di propidio.

Rimuovere le cellule da quattro gradi Celsius e centrifugare a 390 ×g per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare la maggior parte del fissativo lasciandone circa 50 microlitri. Quindi vortexare.

Per allentare il pellet e denaturare il DNA durante la vortexazione. Aggiungere lentamente un millilitro di HCl 2 N con Triton X-100 goccia a goccia, quindi incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti. Pellettare le cellule centrifugando i campioni per cinque minuti a 390 ×g, quindi aspirare e scartare il sopranatante.

Quindi risospendere il pellet cellulare in un millilitro di tetra borato di sodio 0,1 molare. Dopo la centrifugazione, aspirare nuovamente le cellule e scartare il soprannatante. Quindi risospendere il pellet cellulare in 75 microlitri di colorante BRDU.

Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 45 minuti, al riparo dalla luce, dopo l'incubazione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione come in precedenza e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di PBS contenente cinque microgrammi per millilitro di ioduro di propidio. Quando si analizza il campione positivo per PI mediante citometria a flusso, creare un grafico di scattering anteriore rispetto a scattering laterale per verificare la corretta distribuzione dimensionale delle cellule.

Entrambi questi parametri devono essere rappresentati su una scala lineare. Visualizzare contemporaneamente un grafico di FL tre H rispetto a FL due W per osservare la colorazione con PI rispetto alla larghezza dell'impulso fluorescente. Questo grafico viene utilizzato per creare un gating atto a isolare la frazione di cellule ritenute appartenere al pattern di distribuzione normale del ciclo cellulare.

In generale, questo schema di distribuzione è caratterizzato da due gruppi di cellule con contenuto di DNA di due N e quattro N rispettivamente, evidenziati dalla colorazione con PI, che rappresentano le fasi G uno e G due del ciclo cellulare. Una fila di cellule posizionata tra questi due gruppi rappresenta la replicazione del DNA in corso, che avviene nella fase S del ciclo cellulare. Creare un grafico che mostri le cellule selezionate con FL uno H o FITC su scala logaritmica sull'asse Y e PI su scala lineare sull'asse X.

Questo grafico verrà utilizzato per impostare i parametri rimanenti mediante i vari controlli, nonché per raccogliere i dati. Per l'analisi, posizionare il campione colorato solo con PI nel portello di caricamento del citometro a flusso e regolare il guadagno in modo da posizionare il picco G1 a circa 200 sull'asse x. Questo sarà più facile da visualizzare in un grafico istogramma della colorazione con PI.

Successivamente, posizionare il campione contenente solo BRDU nella porta di caricamento ed eseguire l'analisi. Regolare il guadagno in modo che le due popolazioni cellulari, positive e negative per BRDU, appaiano sul grafico. Idealmente, le cellule negative per BRDU devono essere posizionate esattamente su o appena sotto 10 alla uno.

L'ultimo controllo è il campione negativo BDU/trazione PI. Eseguire questo controllo negativo per assicurarsi che le cellule non compaiano in nessuno dei quadranti superiori o destri. Una volta impostati i parametri dei vari grafici, il citometro a flusso viene calibrato e risulta pronto per l'elaborazione delle cellule marcate con BRDU e PI. Raccogliere dati da un minimo di 10.000 cellule selezionate tramite PI per ogni campione.

Quindi, utilizzando software come FlowJo o FACS Diva, creare un grafico di FITC contro PI, selezionando le cellule positive a PI dal grafico bidimensionale di PI contro FL2. Per distinguere la popolazione in ciclo. Successivamente, generare una seconda selezione per isolare la popolazione positiva a BrdU.

Quindi, per tracciare l'andamento temporale del progresso del ciclo cellulare, tracciare il numero di cellule positive per BRDU con contenuto G1 o G2 in funzione del tempo per confrontare la progressione del ciclo cellulare. Cinetiche tra due linee cellulari colorettali HT 29 e LS 180. Le cellule sono state raccolte ogni ora per otto ore a seguito della rimozione del picco di A-B-R-D-U.

Confrontando la cinetica dei due profili, emerge un picco di G uno evidente al tempo t uguale a quattro ore post BRDU nelle cellule LS 180 rispetto al corrispondente punto temporale della linea cellulare HT 29, che non presenta questo picco. Ciò indica una progressione accelerata del ciclo cellulare attraverso la fase G due del ciclo cellulare. Nella linea cellulare del cancro del colon-retto LS 180 per generare un profilo di ciclo della linea cellulare del cancro al seno.

Le cellule MC seven sono state raccolte ogni ora per otto ore, successivamente alla rimozione del pulse di BRDU. Le cellule marcate con immunofluorescenza e colorate per il controcolorante del DNA sono state quindi ordinate in base ai loro segnali fluorescenti.

Come si può osservare qui, le cellule CF7 hanno avuto un ciclo cellulare significativamente più lento rispetto a ciascuna delle due linee cellulari colorettali testate. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come l'etichettatura metabolica del DNA in combinazione con il prelievo in diversi punti temporali permetta di tracciare la cinetica del ciclo cellulare.