Tomografia Computerizzata guidata nel dominio del tempo Tomography Diffuse fluorescenza in animali di piccola taglia per la localizzazione dei biomarcatori tumorali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è produrre immagini di fluorescenza dell'espressione del recettore del fattore di crescita epidermico in un modello murino di glioma ortotopico. Questo risultato si ottiene inoculando l'emisfero cerebrale sinistro di un topo A IIC con cellule di glioma umano U2 51 che esprimono la proteina verde fluorescente. Dopo due settimane di crescita tumorale, il topo viene iniettato con un cocktail di due traccianti fluorescenti.

Il topo viene quindi sottoposto a imaging mediante un sistema radiografico per piccoli animali per acquisire i dati anatomici necessari per una ricostruzione accurata delle immagini. Questi dati vengono utilizzati per posizionare anatomicamente la sorgente e determinare le posizioni dei rilevatori del sistema di tomografia ottica, e un software personalizzato viene impiegato per raccogliere i dati di fluorescenza e costruire l'immagine finale. In definitiva, questo metodo permette di ottenere un'immagine di un tumore sulla base della sua sovraespressione del fattore di crescita epidermico, combinando imaging fluorescente e radiografico, la cui accuratezza può essere confrontata con quella dell'imaging a risonanza magnetica con mezzo di contrasto.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tomografia fluorescente per piccoli animali basata su dispositivi a accoppiamento di carica, è che il rilevamento a conteggio di fotoni singoli mediante tubi fotomoltiplicatori offre una sensibilità e una gamma dinamica molto più elevate nella rilevazione della luce. Questo metodo può essere utilizzato in ultima analisi per monitorare e valutare il successo di terapie molecolari misurando l'espressione dei loro bersagli. Sebbene i tumori sottocutanei possano essere facilmente immaginati con metodi non tomografici mediante imaging superficiale, questo sistema è progettato per effettuare immagini attraverso tessuti spessi fino a diversi centimetri, risultando particolarmente adatto all'immagine, al confronto, alla somministrazione di agenti di contrasto e alla loro fuoriuscita nei tumori cerebrali.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'espressione dei biomarcatori del cancro, può essere applicato anche ad altri studi di patologie come infezioni, obesità o elementi legati all'invecchiamento, come l'Alzheimer. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà a causa della natura diffusa della propagazione della luce nei tessuti biologici e della complessità nell'utilizzare la tomografia a raggi X per la ricostruzione della luce diffusa. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Considerando che le fasi di acquisizione dati e ricostruzione delle immagini possono essere difficili da apprendere, è importante assicurarsi che i dati raccolti dal sistema fluorescente siano ben calibrati. Il pacchetto software near fast è stato progettato per leggere i dati ottici e utilizzare le immagini di tomografia a raggi X per creare una mesh a elementi finiti, che viene usata come modello spaziale per la ricostruzione della fluorescenza. Per iniziare, posizionare un topo nudo atimico anestetizzato su un telo chirurgico sterile e verificare la profondità dell'anestesia prima di procedere; quindi pulire e disinfettare la cute nella zona di incisione.

Utilizzando Betadine, posizionare un telo chirurgico sterile sul sito dell'incisione; con un bisturi, effettuare una piccola incisione leggermente a sinistra della linea mediana e 0,5 centimetri posteriormente rispetto alla linea interoculare. Pulire la superficie del cranio rimuovendo ogni tessuto connettivo in modo da poter identificare i punti di riferimento anatomici. Una volta esposto il cranio, utilizzare un trapano ad alta velocità con una punta sterile da un millimetro per creare un foro situato due millimetri a sinistra della linea centrale e due millimetri al di dietro rispetto al bgma.

Caricare una siringa Hamilton Micros con un ago ottuso da 27 gauge con le cellule da impiantare. Successivamente, posizionare il topo su un telaio stereotassico. Quindi, confermare un piano anestetico chirurgico profondo con una pinzatura del dito del piede e sostituire il campo operatorio sull'animale.

Successivamente, fissare la siringa caricata sul telaio stereotassico. Posizionare la siringa sopra il foro nel cranio e inserire la punta dell'ago a tre millimetri sotto la superficie del cranio. Successivamente, ritirare l'ago di un millimetro per creare una tasca.

Il passo successivo consiste nell'iniettare lentamente le cellule nell'emisfero cerebrale sinistro nel corso di un periodo di cinque minuti. Al termine dell'iniezione, ritirare l'ago e tamponare il foro con Betadine. Per impedire la crescita delle cellule al di fuori del sito di iniezione, rimuovere il topo dal telaio stereotassico e riempire il foro esposto con cera ossea preriscaldata.

Infine, chiudere il sito dell'incisione con sutura sterile in nylon 5-0. Riporre il topo in una gabbia riscaldata e monitorare fino al completo recupero; dopo il recupero, iniettare il topo con 130 microlitri di buprenorfina 0,1 milligrammi per chilogrammo per via intraperitoneale e lasciare crescere il tumore per 14 giorni prima dell'imaging. Nel giorno dell'imaging del topo, avviare il sistema per consentire ai laser e ai rivelatori di luce di riscaldarsi per circa 20 minuti.

Per evitare deriva e variazioni di sensibilità del sistema, posizionare esattamente al centro del supporto di imaging un diffusore lineare progettato di 100 gradi per quattro gradi per distribuire i laser di eccitazione tra i canali di rilevamento del sistema con uguale intensità. Regolare manualmente l'angolo del diffusore per massimizzare il segnale rilevato da tutti e cinque i canali di raccolta della luce. Successivamente, posizionare la densità ottica.

Due filtri di densità neutrale davanti a tutti i fotomoltiplicatori (PMT) per la rilevazione della fluorescenza e densità ottica. Un filtro di densità neutrale davanti a ogni rilevazione di trasmissione. I PMT raccolgono 100 funzioni di allargamento temporale dell'impulso o TPSF del laser, ciascuna con un tempo di integrazione di un secondo per ogni laser in sequenza, normalizzano ogni TPSF rispetto al riferimento del laser, correggono la deriva temporale del riferimento del laser e mediano su tutte le iterazioni per ciascun rivelatore e per ciascun laser separatamente.

Questi TPS medi sono le funzioni di risposta strumentale specifiche del rilevatore utilizzate nella ricostruzione dell'immagine ottica 12 ore prima della procedura di imaging. Iniettare nel topo in prova un cocktail di traccianti fluorescenti. La calibrazione accurata del sistema di tomografia fluorescente e la limitazione del movimento dell'animale sono gli aspetti più difficili di questa procedura.

La ricostruzione dell'immagine è così mal posta che anche errori minimi nella raccolta dei dati possono portare a errori significativi nell'immagine ricostruita. Per garantire una raccolta dati accurata, immobilizziamo il topo nel modo più accurato possibile e ripetiamo la calibrazione prima e dopo la scansione per aumentare la probabilità di ottenere una calibrazione precisa. Quando pronto, posizionare l'animale anestetizzato sui supporti in fibra di vetro del lettino di imaging.

Dopo aver posizionato la testa all'interno del cono nasale per l'anestesia gassosa continua, fissare i denti sulla barra bite e immobilizzare l'animale con del nastro adesivo. Il topo deve essere posizionato approssimativamente al centro del gantry di imaging. Questo posizionamento può essere guidato ruotando il laser di eccitazione di 180 gradi attorno al topo, assicurandosi che il punto focale del laser illumini un punto pressoché centrale rispetto al topo, visto dalla prospettiva del laser, a ogni angolo.

Dopo aver posizionato correttamente, trasferire con attenzione il lettino di imaging e il topo al microscopio TC e acquisire informazioni anatomiche con una risoluzione isotropica di 93 micrometri per l'intera testa del topo. Visualizzare la serie di immagini TC e selezionare le sezioni da acquisire con il sistema di tomografia a fluorescenza. Trasferire con cura il lettino di imaging e il topo nuovamente al sistema di tomografia a fluorescenza.

Scegliere il numero di posizioni della sorgente per ciascuna sezione di imaging, il tempo di integrazione per ogni misurazione TPSF, il numero di iterazioni per ciascuna posizione della sorgente e la posizione e il numero delle sezioni di imaging desiderate a partire dallo stack di immagini TC creato in precedenza. Successivamente, posizionare dei filtri davanti ai fotomoltiplicatori di rilevamento della fluorescenza per bloccare tutta la luce di eccitazione e inserire filtri di densità neutra con densità ottica davanti ai fotomoltiplicatori di rilevamento della trasmissione. Per evitare la saturazione di questi rivelatori, eseguire il software di acquisizione dati per raccogliere i TPSF di fluorescenza e trasmissione in ogni posizione definita tra sorgente e rivelatore, a entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione.

Per ogni serie di psf di T acquisite, monitorare e registrare l'intensità del laser mediante un canale PMT di riferimento. Determinare la superficie esterna del topo e la posizione del piano di imaging. Utilizzare le aste di supporto dalle immagini di TC e creare maschere che ricoprano i confini del topo e dell'asta di imaging.

Separatamente, utilizzare la maschera del mouse per produrre una mesh a elementi finiti dell'animale mediante il software near fast. Localizzare le posizioni della sorgente e del rivelatore del sistema di tomografia a fluorescenza sulla superficie della mesh in base alle coordinate di registrazione spaziale ottenute dalla micro-TC e dalla fluorescenza. Rimuovere i punti dati ottici associati alle posizioni della sorgente o del rivelatore che interagiscono con la posizione del lettino di imaging.

Le bacchette di supporto normalizzano i dati raccolti in ogni posizione sorgente-rivelatore mediante il riferimento laser, correggendo alla deriva temporale del riferimento laser e alle sensibilità dei filtri, determinate mediante test sperimentali al momento dell'acquisto. Si calcola il rapporto di Born per i dati di ogni posizione sorgente-rivelatore e lo si moltiplica per una simulazione del modello diretto della trasmittanza basata sulla mesh animale a elementi finiti per proprietà ottiche uniformi. Questo passaggio serve per ridurre gli errori associati all'accoppiamento del tessuto con la sorgente o con il rivelatore, per calibrare i dati al modello e per correggere i dati in relazione ad altri aspetti di discrepanza tra modello e dati; si costruisce quindi un vettore di dati composto dalla differenza scalata dei dati del rapporto di Born raccolti a entrambe le lunghezze d'onda.

Il fattore di scala viene scelto per massimizzare il contrasto del legame dell'EGFR, eseguire la ricostruzione dell'immagine nel dominio temporale con i dati differenziali calibrati utilizzando la TPSF per ogni canale di rilevamento come ingresso e creare mappe di fluorescenza del tracciante mirato con contrasto migliorato osservato. Di seguito è riportato un esempio di una ricostruzione di fluorescenza sovrapposta a un'immagine anatomica CT coregistrata proveniente da un topo con un tumore ortotopico di glioma U251. Il centro di massa del glioma determinato mediante la ricostruzione della fluorescenza era entro un millimetro rispetto al centro di massa del tumore determinato mediante risonanza magnetica con contrasto.

Il software per l'acquisizione dei dati è stato sviluppato appositamente per questo dispositivo, ma la maggior parte delle tecniche di elaborazione delle immagini può essere eseguita utilizzando il software near fasts disponibile su @nearfasts.org. Pertanto, durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale assicurarsi che sia il sistema che i dati siano calibrati con precisione prima della ricostruzione delle immagini. Questa calibrazione richiede che vengano considerate le differenze di sensibilità e temporali tra i rivelatori, a seguito della ricostruzione dell'immagine di un tracciante mirato a un biomarcatore.

L'analisi con imaging di un tracciante non mirato fornisce un metodo per correggere l'assorbimento non mediato da recettori. Ciò consente di quantificare sia la quantità di legame del tracciante che la densità dei recettori in vivo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha ispirato altri ricercatori a progettare sistemi di tomografia a fluorescenza guidati da imaging a raggi X, aprendo la strada all'imaging dell'intero organismo in animali di maggiori dimensioni.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di tomografia fluorescente diffusa, che combina sistemi di imaging anatomico a raggi X e di imaging ottico per l’imaging di biomarcatori tumorali.