Protocolli di colorazione di isole pancreatiche umane
23 maggio 2012
Questo video mostra le procedure per la caratterizzazione di isole pancreatiche umane utilizzando ematossilina ed eosina (H & E) e di immunoistochimica (IHC). Sezioni del pancreas di testa, corpo, e le regioni di coda sono macchiati sia da H & E e IHC per determinare la composizione delle isole endocrine (insulina, glucagone e polipeptide pancreatico), la replicazione cellulare (Ki67), e infiltrati infiammatori (H & E, CD3). La regione uncinato è localizzato usando IHC per il polipeptide pancreatico.
L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare gli isolotti pancreatici umani mediante colorazione con ematossilina ed eosina e immunohistochimica. Questo viene ottenuto creando sezioni seriali da un campione di pancreas incluso in un blocco di paraffina. Le sezioni vengono quindi posizionate su vetrini mantenendo la loro orientazione originale.
Una parte dei vetrini viene colorata con ematina ed eosina, mentre i vetrini rimanenti vengono colorati mediante immunohistochemia; l'ultimo passaggio consiste nello scansionare i vetrini colorati e organizzarli per caso. Infine, queste immagini possono essere caricate su un database online di anatomia patologica, dove possono essere visualizzate da altri ricercatori del settore. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che i vetrini vengono colorati in serie mantenendo la loro orientazione originale.
La procedura sarà dimostrata da Linda Snyder, istotecnologa, Emily Montgomery, scienziata biologa, e Tiffany Hippo, tecnico di laboratorio nel mio laboratorio. Per iniziare, preparare il bagnomaria e il microtomo seguendo le procedure standard per la microtomia in paraffina. Successivamente, etichettare i vetrini con carica positiva con il numero del caso, la regione del pancreas e il numero del vetrino.
Dopo aver preparato tutto, posizionare il blocco in paraffina nel morsetto del microtomo con l'etichetta della cassetta sul lato sinistro. Seguendo le normali procedure di microtomia, sezionare il blocco fino a quando il tessuto non viene esposto in modo uniforme. Una volta che il tessuto viene incontrato in modo omogeneo, produrre un nastro di sezioni seriali dello spessore di circa quattro micrometri.
Sono necessarie da tre a sei sezioni, a seconda del numero di colorazioni iniziali richieste. Successivamente, separare le sezioni del nastro. Prendere ciascuna sezione in ordine e posizionarla su un vetrino.
Registrare il numero della sezione con una matita. Se una sezione non è utilizzabile, saltare quel numero e continuare a numerare le sezioni in ordine esatto. Prestare attenzione a mantenere sull'oggetto la stessa orientazione presente nella cassetta, con l'etichetta dell'oggetto orientata a sinistra.
Successivamente, posizionare i vetrini su un portavetrini e lasciarli asciugare tutta la notte. A temperatura ambiente, sigillare nuovamente la superficie del blocco di paraffina con uno strato sottile di paraffina per preservare il tessuto e conservarlo a temperatura ambiente o a meno 20 gradi Celsius. Ripetere questa procedura per il campione successivo.
È importante mantenere la numerazione delle sezioni seriali a ogni livello, come mostrato sopra per la colorazione ematossilina ed eosina. Posizionare il primo vetrino di ogni blocco in un portavetrini, quindi inserire il portavetrini nel primo vassoio dell'autostainatore. Selezionare il programma standard HE e avviare il processo di colorazione.
Al termine della colorazione, rimuovere i vetrini dall'auto-coloratore e posizionarli nella cappa per l'applicazione del coprioggetto. Applicare un coprioggetto su ciascun vetrino utilizzando tecniche standard. Infine, etichettare i vetrini con un'etichetta stampata e lasciarli asciugare completamente nella cappa.
Cominciare configurando lo strumento automatico e preparando tutti i reagenti necessari. Selezionare il programma Daco per le colorazioni doppie. Inserire il numero di vetrini e il trattamento da applicare a ciascuno.
Caricare tutti i reagenti nello stainer automatico seguendo le raccomandazioni del produttore. Successivamente, preparare il TBST e il citrato, i tamponi, gli anticorpi e gli altri reagenti necessari per la procedura. Deparaffinare i vetrini immergendoli in xilene per cinque minuti.
Non permettere che i vetrini si asciughino poiché ciò provocherebbe un fondo eccessivo e una colorazione dei pori durante la deparaffinizzazione. Versare il tampone citrato in un bagnomaria per preriscaldarlo prima dell'uso. Successivamente, sottoporre i vetrini deparaffinizzati a una serie di lavaggi con etanolo.
Risciacquare le vetrini un'ultima volta con acqua deionizzata. Aggiungere i vetrini al tampone citrato preriscaldato e lasciarli sobbollire per 30 minuti. Trascorso questo periodo, trasferire immediatamente i vetrini in un bagno d'acqua a temperatura ambiente fino a quando si saranno raffreddati completamente.
Dopo averli raffreddati, trasferire i vetrini sui supporti del Dayco auto Stainer, avendo cura di mantenere la corretta sequenza. Infine, eseguire il programma di doppia colorazione caricato in precedenza; al termine del programma, rimuovere i vetrini dall'auto-stainer e lasciarli asciugare per almeno un'ora prima della disidratazione.
Per proseguire la disidratazione, trasferirli nell'etanolo al 80% per un minuto. Continuare la disidratazione dei vetrini immergendoli nell'etanolo al 95% e successivamente in quello al 100%. Infine, immergere e tenere i vetrini nel xilene per un minuto.
Montare immediatamente i vetrini con coprioggetti utilizzando cyto seal per completare la procedura. Stampare etichette contenenti le informazioni del caso, inclusi l'organo e il numero del blocco, il tipo di colorazione e la data. Apporre un'etichetta su ogni vetrino per scansionare i vetrini colorati.
Posizionarli sul vassoio di uno scanner e seguire le procedure standard. Archiviare le diapositive colorate a temperatura ambiente e tutte le diapositive residue non colorate a meno 20 gradi Celsius per utilizzi futuri. Infine, organizzare le immagini colorate in base al donatore e al tipo di tessuto osservato.
Di seguito è riportato un esempio di colorazione per KI 67 e insulina a entrambi i livelli di ingrandimento, basso e alto. Le immagini delle sezioni pancreatiche colorate vengono inserite in un database patologico online, creando una biobanca virtuale. Utilizzando questo database, i ricercatori possono accedere rapidamente alle informazioni necessarie per la ricerca sul diabete di tipo 1.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e colorare vetrini di alta qualità provenienti dal pancreas umano.
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici
Panoramica
In questo video vengono illustrate le procedure per la caratterizzazione delle isole pancreatiche umane mediante colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e immunohistochemia (IHC). La tecnica consente la valutazione della composizione endocrina delle isole, della replicazione cellulare e degli infiltrati infiammatori.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Endocrinologia
- Organizzazione dei tessuti
Sfondo
- Le isole pancreatiche umane svolgono un ruolo cruciale nel metabolismo del glucosio.
- La caratterizzazione della composizione delle isole è essenziale per comprendere il diabete.
- L'ematoxilina-eosina (H&E) e l'immunocitochimica (IHC) sono tecniche standard per l'analisi dei tessuti.
- Il mantenimento dell'orientamento originale dei vetrini è fondamentale per una valutazione accurata.
Scopo dello studio
- Caratterizzare gli isolotti pancreatici umani.
- Determinare la composizione endocrina degli isolotti.
- Valutare la replicazione cellulare e le risposte infiammatorie.
Metodi Utilizzati
- Creazione di sezioni seriali da campioni di pancreas inclusi in paraffina.
- Colorazione delle sezioni con emoalume-eosina (H&E) e immunohistochimica (IHC).
- Scansione dei vetrini colorati per l'analisi.
- Organizzazione delle immagini per caso ai fini del caricamento nel database.
Risultati principali
- Identificazione di insulina, glucagone e polipeptide pancreatico negli isolotti.
- Valutazione della replicazione cellulare mediante colorazione per Ki67.
- Valutazione degli infiltrati infiammatori mediante colorazione con ematossilina-eosina e CD3.
- Localizzazione riuscita della regione uncinata mediante immunoeistochimica (IHC).
Conclusioni
- Il metodo fornisce una caratterizzazione completa delle isole pancreatiche.
- Mantenere l'orientamento originale del vetrino migliora l'accuratezza dell'analisi.
- I risultati contribuiscono alla comprensione della funzione pancreatica in condizioni fisiologiche e patologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
I flussi di lavoro standardizzati di istopatologia per gli isolotti pancreatici umani consentono una caratterizzazione riproducibile delle cellule endocrine, supportando la validazione degli bersagli nella ricerca sul diabete. Preservando l'orientamento delle sezioni seriali e generando immagini digitali complete di intere diapositive, il metodo facilita la condivisione multidisciplinare dei dati e la creazione di biobanche per la riduzione del rischio meccanicistica delle terapie mirate agli isolotti. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici fornendo dati quantificabili e risolti spazialmente sulla composizione degli isolotti, sulla replicazione e sugli infiltrati immunitari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante rigorosa istopatologia e immunolocalizzazione delle cellule endocrine delle isole.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico caratterizzando la morfologia, le dimensioni, la densità e la composizione delle cellule endocrine delle isole mediante colorazioni con ematossilina-eosina (H&E) e immunoenzimatica (IHC).
- Valore predittivo: Aiuta nel triage del portafoglio valutando la replicazione delle isole e le cellule apoptotiche mediante Ki67 e altri marcatori di proliferazione.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi attraverso un processo standardizzato del pancreas umano in regioni definite (testa, corpo, coda) e sezioni trasversali.
- Valore operativo: Affronta la standardizzazione e la riproducibilità dei saggi numerando e indicando alfabeticamente le sottosezioni in base alle dimensioni, consentendo un'analisi completa delle sezioni trasversali.
- Valore della piattaforma: Evidenzia la prontezza per lo screening e la scalabilità mediante immagini digitali a tutto vetrino organizzate in un database online di patologia accessibile a oltre 200 ricercatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discute la rilevanza clinica valutando le isole per infiammazione, fibrosi, amiloidosi e infiltrati di linfociti T mediante colorazione con ematossilina-eosina e anti-CD3.
- Valore operativo: Descrive la continuità dallo stadio di scoperta alla validazione preclinica mediante la valutazione sia dei compartimenti endocrini che esocrini, inclusa la patologia duttulare e le neoplasie.
- Progressione basata sulla valutazione del rischio: Si concentra sulla riduzione del rischio predittivo caratterizzando la neoplasia intraduttale del pancreas e la sua relazione con il sistema duttale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino alla valutazione preclinica, consentendo il sezionamento seriale, la colorazione standardizzata e la biobanca digitale del tessuto pancreatico umano.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante istopatologia e immunolocalizzazione delle isole pancreatiche e delle cellule endocrine.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio mantenendo l'orientamento originale del vetrino durante il sezionamento seriale e la colorazione in serie.
- Analisi: Evidenzia misurazioni quantitative dell'area delle isole, del numero, della composizione delle cellule endocrine, della replicazione e degli infiltrati di linfociti T mediante H&E e IHC, consentendo confronti tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica valutando l'amiloidosi delle isole, la fibrosi e gli infiltrati infiammatori rilevanti per la patogenesi del diabete di tipo 1.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile attraverso un database online di patologia che consente una rapida condivisione dei dati e la selezione di blocchi per sezioni seriali in paraffina o congelate.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella composizione endocrina degli isolotti e nelle interazioni immunitarie.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità del sezionamento seriale, della colorazione e dell'archiviazione digitale dei vetrini.
- Valore strategico: Migliori decisioni di avanzamento o interruzione del progetto, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie all'identificazione precoce della patologia degli isolotti e dello stato di replicazione.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per il rischio, basate su parametri quantificabili di morfologia degli isolotti, densità e fenotipi delle cellule endocrine.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in istotecnologia, immunohistochemia e flussi di lavoro di patologia digitale.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi microtomo, coloratore automatico, scanner di vetrini e accesso a database online di patologia.
- Requisiti di standardizzazione tra team diversi per l'etichettatura dei vetrini, la numerazione delle sezioni e il mantenimento dell'orientamento tra i team di istologia e di imaging.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, in particolare per l'applicazione di una procedura regionale standardizzata (testa, corpo, coda) a pancreas non umani.
- I limiti pratici includono la variabilità del tessuto proveniente da donatori d'organo e la necessità di una validazione ottimizzata degli anticorpi per la colorazione immunohistochemica multiplex.
