Comprensione Formazione cerebellare modello

Sono Kathy Millan. Sono professoressa assistente presso l'Università di Chicago, nel Dipartimento di Genetica Umana e anche nel Dipartimento di Neurologia. Mi occupo di sviluppo cerebrale e, in particolare, di sviluppo del cervelletto, la parte del cervello situata qui dietro, nella parte posteriore del cranio.

E il suo ruolo più noto riguarda lo sviluppo motorio, ma in realtà è coinvolto in molte altre funzioni. Si tratta di una parte del cervello davvero affascinante. La formazione dei pattern è lo sviluppo di modelli in un sistema biologico. È uno di quei termini che i biologi dello sviluppo usano in modo piuttosto generico per indicare quasi qualunque cosa.

E non è davvero chiaro cosa significhi. Credo che ogni biologo dello sviluppo vi darebbe una versione diversa di cosa significhi per me. Ciò che intendo è: come fa il cervello, o in particolare il cervelletto, a distinguere il sopra dal sotto, e come si definiscono la sinistra e la destra?

Come si decide quale parte della struttura diventerà, quale parte? E una volta prese quelle decisioni critiche e fondamentali durante lo sviluppo embrionale, come si fa a far convergere tutta la struttura cellulare per formare la parte estremamente organizzata del cervello che chiamiamo Cervelletto? Siamo quindi particolarmente interessati allo sviluppo del cervelletto e alle informazioni di patterning nel cervelletto in via di sviluppo.

Poiché il cervelletto è un tessuto straordinariamente organizzato. Ha un numero limitato di strati cellulari e un numero ridotto di tipi cellulari. Pertanto, rispetto ad altre parti del cervello, è particolarmente, beh, una struttura relativamente semplice.

E anche perché il cervelletto ha una funzione molto specifica, o comunque una delle tante funzioni è la coordinazione motoria. Quando topi o esseri umani presentano anomalie cerebellari, uno dei fenotipi risultanti è la mancata coordinazione motoria. E così, nell'arco di circa cento anni di genetica del topo, sono stati scoperti e in parte caratterizzati diversi mutanti spontanei del topo, ma altri sono semplicemente stati isolati e conservati sugli scaffali di Jackson Labs, dove si trovano topi con anomalie motorie.

E un gran numero di quei topi, credo che ci siano oltre circa 60 ceppi spontanei, presenta anomalie nello sviluppo del cervelletto. E questa risorsa rappresenta una fonte estremamente preziosa per studiare i meccanismi dello sviluppo che guidano la formazione dei modelli cerebellari. Pertanto, uno degli obiettivi principali del mio laboratorio consiste nell'utilizzare tutti gli strumenti derivati dal Progetto Genoma Umano e dal Progetto Genoma del Topo, nonché i relativi reagenti molecolari, per identificare i geni che sono mutati in tutti quei mutanti spontanei.

E trovando quei mutanti, adottiamo un approccio centrato sul fenotipo per identificare i geni. Quindi non stiamo prendendo casualmente geni e disattivandoli. Stiamo individuando fenotipi e identificando i geni perché, utilizzando questo approccio, troviamo in modo specifico geni particolarmente rilevanti per il sistema di interesse.

Il nostro laboratorio e molti altri laboratori hanno clonato un certo numero di questi mutanti spontanei del topo. E questi mutanti spontanei del topo hanno portato a nuove scoperte biologiche davvero interessanti. Perché stiamo adottando un approccio guidato dal fenotipo.

Non abbiamo preconcetti riguardo al tipo di geni che troveremo. Non stiamo cercando specificamente analoghi di dal ho o mutazioni nei canali. Stiamo identificando i geni dettati dai fenotipi.

E grazie a ciò, stiamo apprendendo molte nuove nozioni di biologia. Ad esempio, uno dei geni o uno dei fenotipi su cui il mio laboratorio ha lavorato, insieme al periodo in cui ero ricercatore postdottorato con un altro collega, Jim Linig, riguarda un topo mutante chiamato dre, che in tedesco significa "giratore" o "che gira come una trottola". Questi topi mutanti sono comparsi per la prima volta nel 1929 in Germania e da allora si sono accumulati presso il Jackson Labs.

Esistono diversi alleli di questo particolare locus, e si sapeva che il cervelletto era formato in modo errato. Tutti i tipi cellulari del cervelletto erano presenti, ma il modello del cervelletto era anomalo. La parte centrale mancava; questa parte centrale è chiamata verme.

E abbiamo scoperto che esisteva un fenotipo embrionale precoce in questi topi che portava al fenotipo adulto. E il fenotipo era il risultato di una mutazione in un gene chiamato LMX uno A, che sta per limb homeo domain containing box uno. Quindi il gene LMX uno A si è rivelato effettivamente un gene particolarmente interessante e importante nella biologia dello sviluppo, poiché è uno dei geni più critici nel definire cosa sia il lato superiore nel sistema nervoso centrale, ovvero cosa sia dorsale.

Senza questa rara mutazione, in realtà nessuno sapeva quale fosse la funzione di questo gene. Di fatto, era stato individuato per altre ragioni nelle cellule produttrici di insulina nel pancreas. Altre persone lo avevano studiato per il suo potenziale ruolo nel diabete.

Ma in realtà, si è scoperto che LMX1A da solo non ha alcun ruolo nello sviluppo del pancreas o nello sviluppo delle cellule dell'ocellino. E in effetti, il suo ruolo principale nello sviluppo consiste nel guidare il patterning dorsale nel sistema nervoso centrale. Quando abbiamo clonato per la prima volta il gene DR, il gene LMX1A, abbiamo capito che viene espresso soltanto nella parte dorsale del sistema nervoso centrale.

E in effetti, non è espressa soltanto nella parte dorsale del sistema nervoso centrale o nella lamina dorsale, che è così chiamata proprio intorno al cervelletto. In realtà, è espressa nella parte dorsale del sistema nervoso centrale lungo tutta la lunghezza assiale dell'embrione di topo. E in effetti, è espressa lungo tutta la lunghezza assiale di ogni vertebrato che abbiamo esaminato finora.

E poiché è espresso dorsalmente in ogni parte, abbiamo ipotizzato che debba avere un ruolo dorsale anche in altre regioni del sistema nervoso centrale. Così abbiamo effettivamente dedicato molto tempo a caratterizzare il fenotipo dei topi DR nel midollo spinale, perché il midollo spinale rappresenta in realtà un sistema modello molto migliore per comprendere lo sviluppo del SNC rispetto al cervelletto, in quanto è molto meno complesso dal punto di vista tridimensionale. Presenta una struttura tridimensionale notevolmente ridotta.

Passando al pollo, siamo effettivamente riusciti a sfruttare un gran numero di reagenti per comprendere quale fosse il ruolo di LMX1A nel midollo spinale. Dal midollo spinale, siamo poi tornati al cervelletto. E francamente, non credo che senza la tecnologia dell'embriologia del pollo avremmo potuto comprendere appieno le funzioni del gene LMX1A. Un ricercatore postdottorato nel mio laboratorio, Victor Chiko, è stato la persona che ha effettivamente condotto e portato avanti questi esperimenti.

E lui è stato effettivamente la persona che ha scoperto a cosa serve il gene LMX1A e il suo ruolo principale nel sistema nervoso centrale, utilizzando il sistema di elettroporazione del pollo. E francamente non credo che saremmo riusciti a fare tanti progressi quanti ne abbiamo fatti senza l'elettroporazione del pollo. Quindi l'elettroporazione del pollo è una tecnologia davvero preziosa perché consente di sovraesprimere rapidamente geni nel sistema nervoso in via di sviluppo del pollo, ottenere un risultato dopo due o tre giorni di incubazione e ottenere fenotipi analizzabili.

Se si tentasse effettivamente di eseguire manipolazioni geniche nei topi per ottenere animali transgenici, il processo richiederebbe diversi mesi; per gli knockout, ecc., ci vorrebbe almeno un anno e mezzo. Pertanto, il sistema del pollo rappresenta un sistema davvero prezioso, poiché consente di manipolare l'espressione genica e di individuare rapidamente i fenotipi. Così, quando LMX1A viene sovraespresso nel sistema nervoso in via di sviluppo del pollo, in particolare nel midollo spinale in formazione, provoca la trasformazione dell'intera parte dorsale del sistema nervoso centrale, o del midollo spinale, in una struttura simile alla lamina dorsale del sistema nervoso centrale, ovvero alla placca del tetto.

Quindi, ciò che ci hanno indicato, insieme a una serie di altri esperimenti effettuati da Victor, è che LMX1A da solo è responsabile dell'attivazione dell'intero programma di differenziazione della lamina tetto. Questo è importante perché la lamina tetto rappresenta un centro di segnalazione fondamentale nel sistema nervoso in via di sviluppo. In assenza della lamina tetto, non vengono secreti morfogeni in grado di indurre le cellule adiacenti del tubo neurale a differenziarsi in neuroni sensoriali dorsali.

E senza quei segnali, quelle cellule passano a uno stato predefinito di un tipo cellulare intermedio. E si perdono la maggior parte dei neuroni dorsali nel midollo spinale, ma anche effettivamente nel cervelletto in via di sviluppo. E non credo che saremmo riusciti facilmente a giungere a tale conclusione utilizzando un sistema diverso dal tubo neurale del pollo.

Siamo particolarmente interessati allo sviluppo del cervelletto, non solo per la biologia fondamentale nei sistemi del topo e anche nel pollo, ma anche perché negli esseri umani esistono malformazioni del cervelletto. Tali malformazioni cerebellari umane sono tuttora molto poco comprese. In collaborazione con un collega, il dottor William Dobbins, uno dei massimi esperti mondiali di malformazioni cerebrali umane, abbiamo avviato un progetto volto a identificare i geni responsabili delle malformazioni cerebellari umane.

Stiamo adottando diversi approcci. Una delle iniziative più importanti che abbiamo intrapreso è la creazione di una banca dati del DNA e di una banca dati clinica, in cui abbiamo reclutato oltre 500 pazienti con malformazioni cerebellari umane ben definite, raccogliendo immagini di risonanze magnetiche e correlandole con campioni di DNA, in modo da poter utilizzare questa risorsa per l'identificazione di geni. Infatti, si è scoperto che le malformazioni cerebellari umane non sono affatto ben categorizzate. E francamente posso affermare che, su ogni 10 scansioni che riceviamo attraverso i nostri studi, almeno una di queste presenta una malformazione mai descritta in precedenza e non realmente riconosciuta prima d'ora.

La malformazione cerebellare umana più comune è chiamata malformazione di Dandy-Walker ed è quella più riconosciuta dai clinici. Ma in realtà si rivela una sorta di diagnosi generica nel campo delle malformazioni cerebellari umane. Qualsiasi medico, o molti medici, quando osservano un cervelletto anomalo, lo classificano come malformazione di Dandy-Walker.

Pertanto, reclutiamo pazienti nel nostro studio sulla malformazione di Dandy-Walker e riscontriamo ogni tipo di interessante malformazione cerebellare. Stiamo quindi utilizzando questa risorsa per individuare nuovi geni coinvolti nello sviluppo del cervelletto, perché, in quanto biologo dello sviluppo, ritengo che gli esseri umani siano un unico grande esperimento di mutagenesi. Costituiscono cioè una fonte straordinaria per la scoperta di nuovi geni dello sviluppo.

Stiamo quindi adottando diversi approcci per individuare questi geni. Uno di questi approcci consiste nell'analizzare in esseri umani i geni che abbiamo identificato nel topo e che svolgono ruoli nello sviluppo del cervelletto, sequenziando tali geni negli esseri umani. In effetti, abbiamo recentemente identificato la prima mutazione umana di LMX1A.

Finora, le applicazioni della nostra ricerca di base nel campo della ricerca clinica sono state davvero limitate. Ma questa situazione sta cambiando rapidamente. Man mano che identifichiamo nuovi geni, possiamo fornire nuove informazioni per la consulenza genetica alle famiglie di bambini affetti.

E francamente, è proprio lì che vedo l'impatto maggiore della nostra ricerca. Pertanto, la mia visione per il campo nei prossimi cinque anni è che verranno scoperti molti più geni, sia attraverso la caratterizzazione di modelli murini sia mediante studi sulle malformazioni cerebellari umane. Avremo una conoscenza più approfondita dell'insieme di geni coinvolti nello sviluppo del cervelletto.

E poi l'obiettivo dovrà essere comprendere in che modo questi geni interagiscono tra loro e come questi geni guidano la biologia effettiva. In che modo determinano tutti i diversi eventi cellulari che si verificano per formare un cervelletto? E ritengo che il cervelletto rappresenti davvero un modello ideale per l'intero sistema nervoso centrale perché, francamente, esistono soltanto da cinque a sette tipi principali di cellule neuronali.

Sono tutti disposti in diversi modi stereotipati. Stiamo apprendendo sempre di più sui molecole che guidano la specificazione e la differenziazione precoce di quei progenitori. Stiamo comprendendo sempre di più il modo in cui queste cellule proliferano.

Pertanto, penso che tra più di cinque anni, ma alla fine, il campo sarà in grado di passare dallo sviluppo del tubo neurale fino allo sviluppo del cervelletto, raggiungendo la forma matura del cervelletto. E poiché il cervelletto è un sistema relativamente semplice, abbiamo la speranza di riuscire a identificare le molecole e gli eventi dello sviluppo che guidano la formazione dell'intero cervelletto. E ritengo che questo sia davvero importante, non solo per il campo della diagnosi genetica negli esseri umani e per lo studio dello sviluppo del cervelletto, ma penso anche che potremo applicare quei meccanismi ad altre parti del cervello.

Il cervelletto è una struttura relativamente semplice, ma molti degli eventi dello sviluppo non saranno esclusivi del cervelletto. Possiamo applicare ciò che abbiamo appreso dal cervelletto ad altre regioni più complesse del sistema nervoso centrale, come la corteccia cerebrale, e utilizzare le conoscenze e i percorsi studiati per comprendere come questi si applichino al resto del cervello.