Isolamento di cellule T CD4 + da Linfonodi mouse utilizzando Miltenyi Purificazione MACS

Questo è un magnete Max MIDI. Riporta la seguente avvertenza: attenzione, campi magnetici estremamente potenti. Ciao, sono Melanie Matthew del laboratorio di Mike Collins presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California, Irvine.

Oggi vi mostreremo la preparazione mediante selezione negativa di cellule T CD4 positive utilizzando i kit della Milton Biotechnology. Qui abbiamo il Minimax e i magneti Minimax: il Minimax viene utilizzato per separazioni su larga scala. È possibile far passare fino a 10^9 cellule attraverso una colonna inserita nel Minimax, mentre i magneti Minimax sono impiegati per volumi cellulari molto più ridotti.

Pertanto, a seconda che si esegua una separazione positiva o negativa, si etichettano le cellule con l'anticorpo appropriato. Questi anticorpi presentano una microsfera magnetica che si attacca al magnete. Nel caso di una selezione negativa, le cellule di interesse passeranno attraverso la colonna e sarà possibile raccogliere l'effluente, che conterrà le cellule di interesse.

Vorrei precisare che le tecniche che vi sto mostrando stasera non sono sterili. Pertanto, se desiderate utilizzare queste cellule per colture cellulari, dovete eseguire ogni passaggio nell'incubatore per colture cellulari usando strumenti sterili. Sebbene vi stia mostrando una procedura per la preparazione di cellule T positive per CD4, molte di queste tecniche possono essere applicate alla purificazione di altri tipi cellulari mediante i kit della Miltenyi Biotec.

Ok, ho rimosso i linfonodi dal topo, e vi mostro come fare questo in dettaglio nel numero sette di JoVE sulla preparazione dei linfonodi per l'immagine a due fotoni. Ora procederò a macinare i linfonodi fino a ottenere una sospensione monocellulare all'interno di un filtro cellulare da 70 micron. Ok, ora macinerò i linfonodi per ottenere una sospensione monocellulare utilizzando la parte posteriore di una siringa da sei millilitri.

I linfonodi si trovano in RPMI all'interno di un filtro, ed è importante ottenere una sospensione adeguata di cellule singole. La ragione per cui si esegue questa operazione in un filtro è assicurarsi di non avere grumi cellulari. Pertanto, una volta terminata la macerazione, rimuoverò il filtro dal mezzo e utilizzerò le cellule che sono passate attraverso il setaccio, ottenendo così la sospensione di cellule singole.

Quando si esegue la macinazione, è necessario assicurarsi di disgregare il più possibile tutti i tessuti. Questa sospensione di singole cellule è quella da cui purificheremo le nostre cellule T positive per CD4. Bene, ora ho terminato la macinazione del tessuto e si può notare che la maggior parte dei linfonodi è praticamente scomparsa.

Abbiamo ancora alcune piccole parti di grasso e una sorta di involucro di un linfonodo qui, con un po' di tessuto connettivo che è tutto aggregato proveniente dai sei linfonodi. Ora rimuovo il filtro cellulare. E potete vedere che il mezzo è molto torbido.

È pieno di cellule provenienti dalla sospensione monocellulare per assicurare che otteniamo il numero massimo di cellule dal filtro, anche se alcune di esse vi aderiranno. Lo lavo con alcuni millilitri di mezzo, quindi trasferisco con una pipetta tutto il mezzo nel tubo Falcon da 15 ml e centrifugo per formare il pellet cellulare da sottoporre successivamente a purificazione. Ecco qui la mia sospensione monocellulare, centrifugata e raccolta a 300 ×g per 10 minuti.

Se si pensa che ci sarà un'alta percentuale di cellule morte nella sospensione di singole cellule, è consigliabile utilizzare il kit per la rimozione delle cellule morte di Miltenyi Tene. Ora che ho centrifugato il campione, verserò via il mezzo e procederò alla lisi dei globuli rossi, quindi conterò le cellule ed eseguirò un kit di selezione negativa per linfociti T CD4 positivi su queste particolari cellule. Ok, ora procedo con la lisi degli eritrociti.

Andremo a lisare i globuli rossi che abbiamo pellettizzato insieme ai linfociti riducendo l'osmolarità della soluzione, aggiungendo prima acqua e poi riportandola a una soluzione 1x mediante l'aggiunta di D-B-P-S 10X. I nostri linfociti sono più resistenti rispetto ai globuli rossi ai cambiamenti di osmolarità, ma dobbiamo comunque lavorare rapidamente per evitare di lisare i linfociti, cosa che non vogliamo fare. Parte del lavorare velocemente consiste nel preparare in anticipo i volumi necessari per la lisi, prima di aggiungere effettivamente l'acqua al sistema.

Quindi voglio essere in grado di aggiungere il mio 10 X-D-B-P-S alcuni secondi dopo aver aggiunto l'acqua, per assicurarmi di non lisare i linfociti e di lizzare invece i globuli rossi. Prendo quindi 900 microlitri di acqua, quasi un millilitro, e cento microlitri di 10 X-D-B-P-S.

Ho entrambi i pipetti pronti all'uso. Nella lisi, aggiungo l'acqua, attendo qualche secondo, forse agito leggermente il tubo, quindi aggiungo il 10 X-D-B-P-S, agitando ancora un po' il tubo. E se si hanno molte cellule del sangue rosso da lisare, si osserverà la formazione di un grosso aggregato amorfo costituito da tutte le membrane cellulari rotte.

Ne abbiamo una piccola quantità qui e si può notare che si tratta di membrane cellulari leggermente danneggiate. Quindi, dopo aver effettuato la lisi, nel caso in cui ci fossero stati errori durante il pipettaggio, preferisco aggiungere alcuni millilitri di mezzo alle cellule per assicurarmi che l'osmolarità sia corretta e che non prosegua ulteriormente la lisi. Bene, ora ho i miei linfociti in sospensione come singola cellula.

Anche in questo caso, ho eseguito la lisi dei globuli rossi e ora li centrifugherò per ottenere il pellet. Prima di procedere, li conterò con l'ematocitometro per determinare la quantità di anticorpo da aggiungere per il kit di selezione negativa delle cellule T CD4 positive. Bene, ora centrifugo le cellule in tampone max e potete notare che il pellet è molto più bianco dopo la lisi dei globuli rossi.

E eseguirò una selezione negativa per linfociti T CD4 positivi. Quindi verserò via tutto il mezzo, tutto il buffer Max in cui ho sospeso le cellule. E procederò all'etichettatura con il cocktail di anticorpi biotinilati, che corrisponde al passaggio uno della selezione negativa per linfociti T CD4 positivi.

E poi incubo in frigorifero per 10 minuti. Ok, quindi le mie cellule hanno completato l'incubazione iniziale. Ora aggiungerò l'antibiotico alle microsfere e le rimetterò in frigorifero per 15 minuti.

Pertanto, per questa particolare separazione cellulare, utilizziamo una colonna LS di Miltenyi Biotec e, come prima cosa, la posizioneremo sul supporto magnetico e prepareremo la colonna facendovi passare attraverso tre millilitri di buffer MACS. A questo punto, aprirò la colonna e la posizionerò in modo che i perni siano rivolti verso l'interno, all'interno del magnete. Ora aggiungerò il buffer MACS nella colonna e si dovrà osservare il liquido scendere lungo la colonna LS e iniziare a gocciolare dalla parte inferiore. Non è un problema se la colonna si svuota completamente.

La tensione superficiale del liquido impedirà che si asciughi fino a quando non aggiungerete le cellule. Prima di aggiungere le cellule, è importante lasciare che il buffer Max penetri completamente attraverso la colonna. Bene, dopo l'incubazione di 15 minuti con le nostre perle magnetiche di anbiotina legate alle cellule e al buffer Max, verserò via il buffer e le ri-sospendrò in un volume di buffer appropriato rispetto al numero di cellule.

Quindi dovrete verificare il vostro protocollo milli tiny per questo passaggio. Poi applicherò il campione alla colonna che abbiamo appena risciacquato con buffer max. Ora aggiungeremo la sospensione cellulare alla colonna.

E poiché questa è una colonna di selezione negativa, raccoglieremo le cellule che sono passate attraverso di essa, che in questo caso dovrebbero essere tutte cellule T CD4 positive. Ora procederò a lavare la colonna con 12 ml di buffer MAX e, ancora una volta, raccoglierò il flusso eluente, che dovrebbe contenere solo cellule T CD4 positive. A questo punto, centrifugerò le cellule T CD4 positive, le risospendero' in soluzione e quindi le marcherò con il colorante appropriato che userò per l'immagine di tau.

Preleverò anche un piccolo campione delle cellule che ho purificato, le etichetterò con anticorpi anti-CD3 e anti-CD4 e le analizzerò mediante FACS per verificare di avere una popolazione pura di linfociti T positivi per CD4. Ecco un'occhiata alle cellule che abbiamo appena centrifugato. Queste dovrebbero rappresentare una popolazione pura di linfociti T positivi per CD3 e CD4.

Quindi vi ho appena mostrato la selezione negativa per le cellule T CD4 positive. Utilizzando il kit della biotech Milit tiny, trasferiremo in modo adottivo queste cellule in un topo e le useremo per uno dei nostri esperimenti con T Photon e macchina. Buona fortuna con i vostri esperimenti.