NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

L'obiettivo generale di questa procedura è lo studio del metabolismo. Utilizzando l'imaging del NADH in una preparazione di cuore funzionante, ciò si ottiene isolando innanzitutto il cuore di coniglio. Il secondo passaggio della procedura consiste nel cannullare con successo tutte e quattro le camere cardiache per ottenere un modello di cuore funzionante.

L'ultimo passaggio consiste nell'impostare l'apparecchiatura per l'acquisizione delle immagini e nel raccogliere dati relativi all'NADH a diverse frequenze di stimolazione. In definitiva, i risultati possono mostrare le variazioni metaboliche del cuore mediante l'immagine dell'NADH fluorescente. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la perfusione retrograda di Langendorff, è che il cuore opera nel suo stato fisiologico, con flusso nella direzione normale e con il cuore stesso che genera la pressione necessaria per la perfusione coronarica.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali in elettrofisiologia e nei meccanismi delle aritmie letali. Ciò avviene fornendo un modello fisiologico per studiare il legame tra il flusso coronarico, il metabolismo e l'attività elettrica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché le fasi di canulazione dei vasi e delle camere cardiache sono difficili da apprendere.

Una tecnica inadeguata può danneggiare il cuore e compromettere il resto dell'esperimento. Prima di eseguire un esperimento, risciacquare tutti i tubi nelle camere del sistema cardiaco con acqua purificata, quindi rimuovere l'acqua dal sistema azionando le pompe. Aggiungere filtri a membrana di cellulosa in linea con la pompa di perfusione LOR, la pompa di perfusione del cuore sinistro e la pompa di perfusione del cuore destro.

Dopo aver aggiunto il PERFUSE eight al sistema, eseguire una calibrazione a due punti per ogni sensore di pressione. Accendere il bagno d'acqua riscaldato a circolazione che riscalda i tubi rivestiti d'acqua e gli scambiatori di calore. Accendere il bagno d'acqua utilizzato per riscaldare il PERFUSE eight.

Accendere le pompe che fanno circolare il PERFUSE eight in un circuito chiuso; accendere il serbatoio di circolazione per ossigenare il Perfuse. Eight, assicurarsi che l'ossigenatore in microfibra o i filtri ematici forniscano il 95% di ossigeno al perfuso eight a 80 chilopascal. Infine, verificare che gli scambiatori di calore mantengano la temperatura del perfuso in circolazione.

A 37 gradi Celsius, iniziare l'escissione cardiaca impostando prima il sistema cardiaco in funzione in pressione costante. Modalità LRF. Impostare la pressione del blocco aortico tra 50 e 60 dopo aver sedato un coniglio.

Iniettare pentobarbital e eparina nella vena marginale dell'orecchio o nella vena safena laterale sulla parte interna dell'arto posteriore. Una volta che il coniglio ha perso il riflesso del dolore, aprire rapidamente la cavità toracica. Tagliare il pericardio, clampare l'aorta ed escindere il cuore e i polmoni.

I polmoni vengono mantenuti attaccati per facilitare l'isolamento delle vene polmonari. Successivamente, riempire una siringa con 60 millilitri per F otto e 200 unità di eparina. Applicare una cannula da cinque millimetri ed eseguire la cannullazione dell'aorta.

Fissare l'aorta alla cannula con suture di seta di calibro zero. Quindi premere lentamente la siringa per espellere il sangue attraverso il cuore. Configurare il sistema del cuore funzionante collegando innanzitutto il cuore al blocco aortico.

Avvicinarsi al connettore con un angolo obliquo e permettere al Perfuse eight di gocciolare delicatamente dal connettore nella cannula mentre è collegato. Questo impedisce all'aria di entrare nell'aorta, prevenendo così emboli coronarici durante la perfusione del cuore a pressione costante. Modalità L endorf.

Rimuovere il tessuto adiposo e il tessuto connettivo e individuare i seguenti vasi. Vena cava inferiore e superiore, vena aortica, arteria polmonare e vene polmonari. Successivamente, legare la vena cava superiore.

Tagliare l'arteria polmonare appena al di sotto del punto in cui si divide nelle arterie polmonari destra e sinistra. I vasi rimanenti sono le vene polmonari. Riunirle tra il cuore e i polmoni e legarle tutte insieme con un solo punto di sutura.

Questo è fondamentale per due ragioni. Primo, legare i vasi collegati ai polmoni garantirà l'assenza di perdite una volta completata la cannullazione. E secondo, è importante isolare entrambe le vene cave per la successiva cannullazione.

Ora rimuovere i polmoni. Praticare un foro di dimensioni appropriate nell'angolo del padiglione atriale sinistro e assicurarsi che sia riempito con abbondante eight. Successivamente, cannuccolare il padiglione mentre la cannula è completamente riempita con eight perfusione.

Quindi, tenendo ferma la tessuto, suturare la cannula all'appendice. Il tessuto dell'appendice auricolare sinistra è estremamente delicato e può strapparsi facilmente. È quindi fondamentale cannulare l'atrio sinistro al primo tentativo, altrimenti potrebbe non essere più possibile.

Accendere la pompa numero due per fornire flusso all'atrio sinistro. Impostare il pre-carico tra due e sei tor per tutta la durata dell'esperimento. Potrebbe essere necessario regolare la pressione.

Mantenetelo entro due millimetri della pressione obiettivo. Ora passate al cuore in modalità lavoro spegnendo temporaneamente la pompa numero uno, la pompa langor. Riducete la pressione aortica a tend tor e quindi aumentatela lentamente fino a raggiungere un valore compreso tra 80 e 100 tor.

Questo consente alla valvola aortica di aprirsi e funzionare come farebbe in normali condizioni fisiologiche. Impostare la pressione finale post-carico su un valore che sia approssimativamente 20. Tore inferiore alla pressione massima del ventricolo sinistro utilizzando una cannula direttamente collegata al sistema.

Canulare l'atrio destro attraverso la vena cava inferiore e fissare la cannula alla vena con punti di sutura. Evitare l'introduzione di bolle d'aria. Accendere la pompa numero tre, la pompa del lato destro, per garantire il flusso all'atrio destro.

Impostare la pressione a circa tre tor. Infine, cannuccolare il ventricolo destro senza permettere l'ingresso di aria e suturare la cannula all'arteria polmonare ery. Questo completa la cannuccolazione biventricolare.

Ora procedere all'acquisizione del segnale. Inserire con attenzione il catetere del trasduttore di pressione nell'aorta attraverso la cannula aortica. Farlo avanzare delicatamente oltre la valvola aortica e all'interno del ventricolo sinistro.

Il segnale della pressione del VD apparirà come previsto quando la punta del catetere è posizionata correttamente. Successivamente, premere delicatamente l'elettrodo del potenziale d'azione monofasico contro l'epicardio ventricolare. È normale la presenza di un lieve artefatto di movimento nel segnale dell'elettrodo.

Successivamente, posizionare un elettrodo bipolare di stimolazione nell'atrio destro per stimolare il cuore secondo la posizione prevista dal disegno sperimentale. E focalizzare la telecamera CCD sulla regione di interesse del cuore. Alla telecamera dovrebbe essere applicato un filtro di emissione.

Per rilevare la fluorescenza del NADH, spegnere le luci ambientali per illuminare in modo uniforme l'epicardio con una sorgente di luce UV presso la postazione di lavoro, alla quale è collegata la telecamera. Impostare il software per acquisire immagini a due fotogrammi al secondo. Quindi selezionare la modalità di aggiornamento in tempo reale per monitorare l'intensità media dei pixel all'interno della regione di interesse.

Se la perfusione è stata adeguata, i livelli di NADH, rappresentati dalla fluorescenza, dovrebbero essere bassi e stabili sulla superficie epicardica. Ora, eseguire l'esperimento quando è completato. Rimuovere il cuore.

Svuotare il PERFUSE otto e i tubi e le camere del sistema con acqua purificata. Sciacquare periodicamente il sistema con soluzione TM mucosale o con una soluzione di perossido di idrogeno diluita seguendo il protocollo descritto. I cuori sono stati stimolati a cicli compresi tra 200 e 400 battiti al minuto.

La pressione ventricolare sinistra (LVP) diastolica era solitamente compresa tra zero e 10 tor; la pressione aortica diastolica minima era di circa 60 tor. La pressione ventricolare sinistra sistolica di picco dipende dalla pressione di riempimento e dalla contrattilità ed è ottimale quando compresa tra 60 e 80 tor; la pressione aortica massima e la pressione ventricolare sinistra massima dovrebbero corrispondere strettamente. I potenziali d'azione monofasici tipici del cuore di coniglio presentano una fase di depolarizzazione rapida e una fase di ripolarizzazione caratteristica. I potenziali d'azione sono stati registrati con facilità dai preparati, ma di solito presentavano un piccolo artefatto da movimento durante la diastole.

Sono stati misurati i valori medi della fluorescenza di NADH in una regione di interesse all'interno del riquadro rosso per monitorare i cambiamenti dello stato redox mitocondriale durante tre cicli di stimolazione con lunghezze di stimolo di 300, 200 e 150 millisecondi, quando la frequenza di stimolazione era vicina al ritmo sinusale. Il livello basale di NADH è rimasto relativamente costante mentre la lunghezza del ciclo veniva accorciata. Sotto i 300 millisecondi, i livelli basali di NADH sono aumentati, con l'aumento maggiore osservato a 150 millisecondi; il segnale oscilla in concomitanza con la contrazione e la frequenza delle oscillazioni corrisponde alla frequenza cardiaca.

L'ampiezza di queste oscillazioni è stata sempre inferiore rispetto alle tendenze su scale temporali più lunghe causate da ischemia o ipossia. L'imaging fluorescente ad alta risoluzione del NADH sulla superficie anteriore completa a 200 battiti al minuto è risultato costante e omogeneo dal punto di vista spaziale a 400 battiti al minuto. I livelli di NADH sono aumentati notevolmente in tutta l'epicardio.

È stata osservata una notevole eterogeneità spaziale, con gli aumenti maggiori che si verificano nelle regioni settali del VD e del VS Una volta padroneggiata. Questa tecnica può essere eseguita in meno di 45 minuti se effettuata correttamente. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di impedire l'ingresso di bolle d'aria nell'aorta o nell'atrio sinistro Dopo questa procedura.

Metodi aggiuntivi, come il caricamento del cuore con un colorante sensibile al voltaggio, possono essere utilizzati per rispondere ad altre domande, ad esempio collegando l'attività elettrica e metabolica sulla superficie del cuore durante scenari patologici come l'ischemia locale dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori in fisiologia cardiaca per studiare il metabolismo cardiaco e le alterazioni della conduzione durante condizioni patologiche, utilizzando un modello più fisiologicamente rilevante.