Nanotopology dell'adesione cellulare su angolo di inclinazione variabile Microscopia Total Internal Reflection Fluorescence (VA-TIRFM)

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la topologia dell'adesione cellulare su un substrato con precisione nanometrica. Ciò viene ottenuto coltivando innanzitutto le cellule su vetrini trasparenti e incubandole con un marcatore fluorescente. Successivamente, la posizione angolare dello specchio regolabile del microscopio viene calibrata e la posizione è memorizzata nel programma di posizionamento dello specchio.

Il passo successivo consiste nell'acquisire le immagini di fluorescenza irradiando a circa 10 angoli diversi. L'ultima fase prevede il calcolo delle distanze tra la cellula e il substrato con una precisione di pochi nanometri. Infine, i risultati sulla topologia dell'adesione cellulare al substrato vengono utilizzati per evidenziare le differenze di adesione tra diverse linee cellulari, ad esempio cellule tumorali e cellule meno maligne.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia confocale è che la risoluzione effettiva è nell'ordine di pochi nanometri. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle membrane cellulari, può essere applicato anche ad altri sistemi, come vescicole piccole o nanomateriali.

La dimostrazione dell'esperimento sarà effettuata dalla nostra ricercatrice Petra, che preparerà i campioni cellulari, e dal nostro ingegnere, Michael Wagner, che eseguirà l'esperimento. Per preparare le cellule per la microscopia a fluorescenza con riflessione interna totale ad angolo variabile, seminare singole cellule a una densità di 100 cellule per millimetro quadrato su un vetrino in mezzo di coltura integrato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici. Coltivare le cellule per 72 ore in un incubatore a 37 °C e 5% di anidride carbonica.

Successivamente, applicare alle cellule il marcatore fluorescente della membrana, sei D, decano due, dimetilammino naftalene o lorano, a una concentrazione di otto micromolari nel mezzo di coltura, e incubare per 60 minuti prima della microscopia a fluorescenza. Lavare le cellule con PBS, pipettando la soluzione tampone sulla lametta per rimuovere il mezzo; in seguito, asciugare la soluzione tampone dal retro della lametta. Si utilizza un microscopio eretto, come un Zeiss Axio plan, dotato di una camera a illuminazione posteriore e/o E-M-C-C-D per angoli variabili.

Sostituire nel T-I-R-F-M il condensatore con un dispositivo di illuminazione personalizzato dotato di un prisma di vetro emicilindrico, accoppiato otticamente al vetrino del campione. Il fascio laser incide attraverso una fibra monomodale collimata, che, dopo essere stato focalizzato dal prisma di vetro e da ulteriori componenti ottici, genera nuovamente un fascio parallelo sulla superficie del campione. Prestare attenzione affinché il vettore del campo elettrico sia polarizzato perpendicolarmente al piano di incidenza.

Questa posizione viene segnata sul coupler di uscita della fibra. Utilizzare uno specchio regolabile posizionato all'interno del condensatore, che viene proiettato nel piano del campione e illumina il campione con un angolo variabile di incidenza o di raggi oggetto. Lo specchio regolabile può essere azionato da un motore passo-passo, controllato mediante software.

Ogni posizione corrisponde a un angolo d'incidenza ben definito, determinato da misurazioni geometriche. Per calibrare la posizione angolare dello specchio regolabile, utilizzare un colorante fluorescente come il nucleotide di flavina ad una concentrazione di un millimolare, disciolto in acqua. Per visualizzare l'angolo critico al variare dell'angolo d'incidenza, utilizzare l'angolo critico di 61,3 gradi per una transizione vetro-acqua come valore fisso; la posizione angolare dello specchio in corrispondenza della quale l'angolo d'incidenza uguaglia l'angolo critico viene memorizzata nel programma di posizionamento dello specchio.

Utilizzando il software della telecamera, impostare i parametri della telecamera E-M-C-C-D, inclusi guadagno della temperatura, tempo di registrazione e velocità di spostamento. Utilizzare olio di immersione per garantire il contatto ottico del campione. Con un prisma di vetro, selezionare un obiettivo con l'ingrandimento appropriato per le cellule e un'apertura numerica moderata.

Per visualizzare l'oggetto al microscopio, utilizzare un filtro passa-alto o passa-banda appropriato per la rilevazione della fluorescenza. Registrare immagini di fluorescenza di campioni identici al variare dell'angolo di illuminazione. Gli angoli di incidenza devono essere uguali o maggiori dell'angolo critico.

Con l'angolo critico corrispondente a 64,5 gradi per un'interfaccia vetro-cella, si raccomanda un intervallo angolare compreso tra 66 e 74 gradi con incrementi di 0,5 gradi o un grado. Per iniziare l'analisi dei dati, utilizzare il programma LabVIEW per leggere le immagini registrate a diversi angoli, nonché le impostazioni della fotocamera, la lunghezza d'onda di eccitazione e gli indici di rifrazione. Per il vetro, pari a 1,52, e per le cellule, pari a 1,37, le impostazioni vengono importate per una corretta valutazione dei dati.

Per ogni serie di parametri, la profondità di penetrazione e il fattore di trasmissione vengono calcolati automaticamente per il successo della procedura. È fondamentale che le immagini vengano registrate e selezionate con attenzione per l'analisi. Selezionare le immagini utilizzate per la valutazione delle distanze tra cellule e substrato in base all'equazione.

Per un marcatore di membrana, singole immagini con illuminazione omogenea, come mostrato in questo esempio, possono essere escluse. Calcolare le immagini della topologia del substrato cellulare e selezionare un codice colore appropriato per la visualizzazione durante la valutazione. I profili dei singoli pixel possono essere visualizzati come raffigurato in questa figura.

Questi profili possono essere utilizzati come indicatore della qualità dell'adattamento. Infine, salvare il protocollo di valutazione. Questa figura mostra immagini di riflessione totale interna di cellule di glioblastoma U2 51 mg con un gene soppressore tumorale TP 53 attivato.

Dopo l'incubazione con luan registrata a diversi angoli di incidenza, 66 gradi corrispondenti a una profondità di penetrazione del campo elettromagnetico evanescente di circa 140 nanometri, 69 gradi, corrispondenti a una profondità di penetrazione di 75 nanometri, e 73 gradi corrispondenti a una profondità di penetrazione di 60 nanometri con penetrazione decrescente. L'intensità della fluorescenza diminuisce con la profondità e proviene da siti più superficiali delle cellule, come i contatti focali sui loro margini. Le distanze tra cellula e substrato sono rappresentate nel Pannello D mediante un codice a colori che varia da zero a 600 nanometri, come mostrato qui.

Le distanze tra cellula e substrato variano notevolmente all'interno delle cellule, passando da soli pochi nanometri, rappresentati dal bianco al giallo, a 250-300 nanometri, rappresentati dal rosso scuro. Ciò indica che i contatti focali e le maggiori distanze tra cellula e substrato si trovano in prossimità immediata. Una variazione simile nelle distanze tra cellula e substrato è stata calcolata per le cellule di glioblastoma U2 51 mg con un gene soppressore tumorale P 10 attivato.

Al contrario, le distanze tra le cellule e il substrato sono piuttosto costanti per le cellule di controllo U2 51 mg, rappresentate in giallo, e per le cellule di tipo selvaggio, rappresentate in arancione fino al rosso, dopo lo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della topologia substrato-cellulare per esplorare le cellule tumorali e i cambiamenti morfologici indotti dalla terapia laser. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come visualizzare superfici con una risoluzione effettiva nell'ordine del nanometro a basse esposizioni luminose, ben tollerabili per organismi viventi.