Estratti nucleari di piccole dimensioni per saggi funzionali di espressione genica Macchinari

L'obiettivo generale del seguente esperimento è analizzare l'espressione genica utilizzando macchinari nucleari funzionali estratti da cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto raccogliendo le cellule HeLa mediante gonfiamento. Successivamente, le cellule vengono lisate per rotture osmotica e quindi centrifugate per ottenere un pellet di nuclei al terzo passaggio.

I nuclei vengono estratti con sale, concentrati e dializzati al fine di ottenere macchinari funzionali per l'espressione genica solubili. In definitiva, la funzionalità degli estratti nucleari può essere valutata in base alle loro attività di trascrizione e splicing, analizzate mediante un sistema accoppiato di RNA polimerasi per trascrizione e splicing. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la preparazione di estratti nucleari in massa, è che con questo metodo è possibile utilizzare una piccola quantità di cellule per preparare l'estratto nucleare.

Iniziare piantando cellule HeLa su tre piastre da 150 millimetri con terreno DMEM integrato con FBS e antibiotici; coltivare le culture in un incubatore a 37 °C con 5% CO₂ fino a quando le cellule non raggiungono una confluenza del 90%. A questo punto, aspirare il terreno dalle colture cellulari HeLa e lavarle una volta con 13 millilitri di PBS a temperatura ambiente per piastra, quindi aspirare il PBS. Lasciare ogni piastra in posizione verticale per alcuni secondi e aspirare il PBS rimanente.

Successivamente, utilizzare un distaccatore cellulare per raschiare le cellule lungo il bordo inferiore di ogni piastra, quindi trasferire le cellule in una provetta da 1,5 millilitri. Infine, formare il pellet cellulare in una microcentrifuga per cinque minuti a cento volte G e a quattro gradi Celsius. Aspirare ora il PBS dal pellet cellulare e stimare il volume cellulare compatto o PCV osservando la graduazione sulla provetta.

Quindi aggiungere un volume di buffer ipotonico pari al doppio del VCM al pellet cellulare. Agitare delicatamente il tubo per risospendere le cellule. Rimuovere delicatamente gli aggregati cellulari, se necessario, pipettando su e giù la sospensione cellulare con una pipetta da 1000 microlitri.

Quindi centrifugare le cellule nelle stesse condizioni di centrifugazione precedenti. Dopo la centrifugazione, aspirare con attenzione il livello di tampone ipotonico. Le cellule avranno iniziato a rigonfiarsi e il volume cellulare sarà aumentato a circa 750-1000 microlitri.

Aggiungere nuovo buffer ipotonico fino a un volume finale di 1,5 millilitri e risospendere le cellule nel buffer. Infine, incubare le cellule risospese e rigonfie sul ghiaccio per 10 minuti mentre le cellule si raffreddano. Sciacquare un omogeneizzatore a pistone con buffer ipotonico e quindi posizionarlo sul ghiaccio insieme alle cellule.

Quindi, utilizzando un fazzoletto morbido per compiti delicati, come un fazzoletto Kim, asciugare il pestello. Utilizzare una punta micro-pipetta da 1000 microlitri con estensione per rimuovere il tampone dai downs. Ora usare la pipetta per trasferire le cellule rigonfie fredde nei downs Down.

La parte più delicata di questa procedura consiste nel verificare con successo il completamento della lisi. Dopo ogni passaggio al microscopio, muovere lentamente su e giù per cinque volte la pestella stretta del dispositivo per lisare le cellule, avendo cura di evitare la formazione di bolle. Successivamente, trasferire cinque microlitri di aliquota della sospensione cellulare lisata in un tubo eppendorf e aggiungere 10 microlitri di tripan blu e 15 microlitri di 1x PBS.

Aggiungere la soluzione cellulare su un vetrino ed esaminare le cellule al microscopio ottico per osservare la lisi; i nuclei delle cellule lisate appariranno blu dopo tre once. La lisi non è sufficiente poiché sono visibili numerose cellule vive. Dopo cinque once, la lisi è adeguata.

Infine, trasferire le cellule lisate nel tubo Eppendorf pre-raffreddato e centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti in una microcentrifuga a 1500 ×g e a 4 °C. Successivamente, trasferire con attenzione il soprannatante in un nuovo tubo senza disturbare il pellet. A questo punto, stimare il volume del pellet nucleare (PNV) osservando le graduazioni sul tubo.

Riempire la punta di una micropipetta con tampone a basso contenuto salino fino a metà del volume nucleare (PNV). Inserire quindi la punta della micropipetta nei nuclei sul fondo del tubo einor. Espellere lentamente il tampone all'interno dei nuclei mescolando delicatamente.

Battere leggermente il tubo per assicurarsi che il pellet sia completamente risospeso. Successivamente, aggiungere il buffer ad alto contenuto salino in quantità pari alla metà del volume del PNV e mescolare rapidamente una sola volta capovolgendo il tubo. Ruotare il tubo per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Infine, centrifugare i nuclei nel microcentrifuga per 15 minuti a 18.000 ×g e a quattro gradi Celsius. Iniziare trasferendo 500 microlitri del soprannatante in microprovette fredde. Centrifugare l'estratto nucleare ad alto contenuto salino per 15 minuti a 14.000 ×g e a quattro gradi Celsius; dopo la centrifugazione, capovolgere il minicolumn e posizionarlo in una nuova provetta EOR singola.

Dopo aver centrifugato per due minuti a 1000 ×g e a quattro gradi Celsius, l'estratto nucleare ad alto contenuto salino verrà concentrato a circa 115 microlitri. Trasferire ora aliquote da 45 microlitri dell'estratto nucleare ad alto contenuto salino in dializzatori mini SLI. Assicurarsi che la parte inferiore del vetrino sia allineata con la parte inferiore del galleggiante.

Quindi posizionare gli SLI in 500 millilitri di tampone di dialisi freddo. Infine, agitare gli aliquote per uno o due ore a quattro gradi Celsius; l'estratto nucleare apparirà torbido dopo la dialisi. Questa figura mostra dati rappresentativi che confrontano una reazione accoppiata di trascrizione da parte della RNA polimerasi due e rimozione degli introni in un estratto nucleare su piccola scala rispetto a un estratto nucleare in grande quantità.

Quando il costrutto A-C-M-V-D-N-A è stato incubato in estratti su larga scala o su piccola scala, livelli simili di pre-mRNA nascente sono stati sintetizzati entro il punto temporale di cinque minuti successivo all'aggiunta di alfa e manin per bloccare ulteriori processi di trascrizione; nel frattempo, gli intermedi di splicing e i prodotti di splicing si sono accumulati nel tempo con cinetiche simili in entrambi i tipi di estratto. Questi risultati rappresentativi confermano che l'efficienza del sistema accoppiato di trascrizione da parte dell'RNA polimerasi II e splicing è simile negli estratti nucleari su larga e su piccola scala. Per dimostrare l'utilità dell'estratto su piccola scala, sono stati preparati estratti da cellule HeLa trattate con l'inibitore dello splicing E 7 1 0 7 o con il composto di controllo negativo Platy analy F, quindi è stato eseguito un saggio accoppiato di trascrizione da parte dell'RNA polimerasi II e splicing come mostrato in questa figura: la trascrizione mediata dall'RNA polimerasi II è avvenuta efficientemente sia negli estratti ottenuti da cellule trattate con plaid F che in quelli trattati con E 7 1 0 7.

Al contrario, lo splicing è avvenuto normalmente nell'estratto preparato a partire dalle cellule trattate con analy F, ma è stato abolito nelle cellule trattate con E 7 1 0 7. Questi dati costituiscono una dimostrazione di principio per l'uso di estratti nucleari su piccola scala in seguito a trattamenti cellulari su piccola scala. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere completata in meno di cinque ore.