Lensfree On-chip Tomographic Microscopia Utilizzando Multi-angolo di illuminazione e Pixel Super-risoluzione

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere un'immagine tridimensionale su chip senza lente di campioni biologici su un ampio volume di imaging. Questo risultato si ottiene innanzitutto posizionando il campione direttamente sul chip del sensore e fornendo un'illuminazione parzialmente coerente. Il secondo passaggio consiste nello spostare lateralmente la sorgente luminosa in diverse posizioni per effettuare la registrazione.

Immagini olografiche del campione con spostamento dei sottopixel. Successivo spostamento dei sottopixel. Le immagini olografiche vengono registrate a multipli di illuminazione per l'imaging tomografico.

L'ultimo passaggio è l'elaborazione dei dati, in cui il set di dati acquisito viene ricostruito digitalmente per ottenere infine immagini tomografiche tridimensionali del campione. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia ottica convenzionale, è che consente un'acquisizione di immagini ad alto rendimento in un'architettura compatta. Ciò rende la nostra piattaforma particolarmente utile per l'integrazione con piattaforme di tipo lab-on-a-chip.

In questo rapporto viene descritta la configurazione di base per l'imaging in un'implementazione da banco finalizzata alla tomografia di campioni statici. Un monocromatore con lampada allo xenon è stato regolato per fornire un'uscita con una larghezza spettrale di circa uno a 10 nanometri intorno a una lunghezza d'onda centrale compresa tra 450 e 650 nanometri. Questa radiazione parzialmente coerente viene quindi accoppiata a una fibra ottica multimodale per trasmettere luce parzialmente coerente al sistema.

La fibra ottica è montata su un banco motorizzato rotante per modificare l'angolo di illuminazione. Il banco motorizzato con la sorgente luminosa collegata è montato su un banco lineare bidimensionale XY, utilizzato per ottenere spostamenti nel piano della sorgente luminosa a un angolo dato per il rilevamento. Viene utilizzato un array di sensori A-C-M-O-S da cinque megapixel con una dimensione del pixel di 2,2 micron.

Il rivelatore viene utilizzato per registrare immagini olografiche con ampio campo visivo dei campioni. È fondamentale che l'array del sensore sia posizionato nello stesso piano assiale dell'asse di rotazione della sorgente luminosa, in modo da verificare che il sensore riceva una quantità sufficiente di luce a grandi angoli di illuminazione. Sebbene la tomografia ottica senza lente possa immaginare una varietà di oggetti come cellule e microorganismi, i principi di base vengono qui dimostrati eseguendo una microscopia tridimensionale di un campione di sea elgan utilizzando un bisturi o una spatola.

Prelevare un piccolo pezzo di agar dal piatto di Petri contenente la coltura degli organi sigillatori. Un pezzo cubico di alcuni millimetri per ogni dimensione conterrà centinaia di nematodi. Posizionare il piccolo frammento di agar in una provetta di polipropilene contenente un millilitro di acqua deionizzata.

Vortexare delicatamente per 30 secondi fino a un minuto. Dopo 10-15 minuti, il verme dovrebbe uscire dall'agar e spostarsi nell'acqua deionizzata. Si noti che i vermi sono troppo piccoli per essere visti qui, al fine di immobilizzarli temporaneamente e un millilitro di cinque-dieci millimolari di Lima.

Quindi aggiungere la soluzione e attendere 10 minuti. Pipettare da cinque a dieci microlitri di campione dalla parte inferiore della provetta e posizionarli tra due coprioggetti. Questo campione, contenente un elevato numero di vermi temporaneamente immobilizzati, può essere collocato sul rivelatore per iniziare l'acquisizione dei dati.

A scopo dimostrativo, in questa sezione vengono riassunti i passaggi per l'acquisizione delle immagini in un tipico esperimento di tomografia ottica senza lente o LOT; tuttavia, l'intero processo è stato automatizzato mediante l'utilizzo di un'interfaccia personalizzata sviluppata in LabVIEW. Per iniziare i passaggi manuali, regolare l'angolo iniziale della piattaforma rotante a meno 50 gradi, dove zero gradi corrisponde alla posizione verticale della sorgente luminosa. Regolare la posizione iniziale della piattaforma XY a zero zero, ovvero alla posizione di riposo.

Regolare il tempo di esposizione del rilevatore per sfruttare al meglio la sua gamma dinamica, in modo che l'immagine sia il più luminosa possibile senza alcun pixel saturato, senza modificare l'angolo dello stadio di rotazione. Acquisire nove immagini per ogni immagine. Spostare lo stadio XY in una nuova posizione secondo una griglia quadrata tre per tre, in modo che ogni immagine si sposti di circa un quarto di pixel rispetto a quella precedente.

L'acquisizione di ulteriori immagini per ogni angolo potrebbe migliorare la risoluzione, a seconda del tipo di oggetto e del rapporto segnale-rumore. Dopo aver raccolto nove immagini all'angolo iniziale, regolare la posizione dello stadio XY tornando alla posizione zero zero. Successivamente, aumentare l'angolo dello stadio di rotazione a incrementi di due gradi fino a raggiungere +50 gradi.

Dopo ogni incremento e a ogni nuovo angolo, ripetere i passaggi descritti. Gli incrementi angolari possono essere più fini o più ampi a seconda dell'ottimizzazione tra tempo di acquisizione e risoluzione dell'immagine. Al termine dell'acquisizione dei dati, viene ottenuto un insieme di 459 immagini, che comprende nove immagini con spostamento sub-pixel per ciascuno dei 51 diversi angoli di illuminazione.

Ogni serie di nove immagini viene elaborata digitalmente mediante algoritmi di super risoluzione pixel per ottenere una singola proiezione ad alta risoluzione. I risultati della super risoluzione pixel per ogni angolo dell'ologramma vengono quindi ricostruiti digitalmente per ottenere 51 immagini di proiezione. L'elaborazione dei dati è mostrata qui utilizzando un laptop.

La ricostruzione richiederebbe meno di un secondo per l'intero campo visivo utilizzando unità di elaborazione grafica. Questo insieme di 51 immagini di proiezione viene quindi retroproiettato utilizzando il plugin Tom OJA. Per Image J, le immagini di proiezione vengono innanzitutto caricate su Image J, dopodiché viene richiamato il plugin Tom OJ.

Una tabella di ricerca che fornisce l'angolo di visione per ogni immagine di proiezione viene caricata su OJ. Utilizzando il metodo di retroproiezione pesata, è possibile ottenere immagini tomografiche tridimensionali del campione. Qui viene dimostrato l'ampio campo visivo della tomografia ottica senza lenti, poiché il campione viene posizionato direttamente sulla sommità dell'array di rilevatori. Immagini olografiche degli oggetti possono essere registrate su un campo visivo di 24 millimetri quadrati, che può essere ulteriormente aumentato utilizzando array di rilevatori emergenti con aree attive più grandi.

Sebbene la dimensione dei pixel dell'array del rivelatore limiti la risoluzione delle immagini olografiche registrate, tecniche di sovrarisoluzione pixel mitigano questo problema; qui sono mostrati ologrammi con sovrarisoluzione pixel, insieme alle immagini di proiezione ricostruite che offrono una risoluzione spaziale submicrometrica per tre diversi angoli di illuminazione. Le immagini di proiezione possono essere combinate utilizzando tecniche di ricostruzione tomografica per calcolare le tomografie del campione. Sono mostrate tre sezioni nel piano XY attraverso la parte anteriore del verme, dove il tubo faringeo è visibile soltanto nella sezione a Z uguale a otto micron, come previsto per questa struttura approssimativamente cilindrica con un diametro esterno di circa cinque micron.

Inoltre, l'immagine trasversale nel piano XZ mostra chiaramente i confini del verme e del tubo faringeo all'interno, dimostrando un'efficace imaging 3D della faringe. Con il suo sviluppo, questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori per eseguire microscopia tridimensionale su volumi di imaging di decine di millimetri. Pertanto, la tomografia ottica senza lente può rappresentare uno strumento utile per applicazioni di imaging ad alto rendimento nelle piattaforme di chip di tipo Lebanon.