Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare quantitativamente la motilità cellulare nel tempo mediante un saggio di motilità cellulare basato su nanoparticelle d'oro. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto coprioggetti di vetro per il rivestimento con nanoparticelle d'oro. In particolare, coprioggetti privi di endotossine vengono rivestiti con gelatina e quindi sottoposti a cottura.

Il secondo passaggio consiste nella riduzione dell'acido clororico, che porterà alla formazione di nanoparticelle d'oro e consentirà di ricoprire uniformemente le lamelle rivestite con gelatina mediante la soluzione. Successivamente, le cellule vengono posizionate sulle lamelle ricoperte di nanoparticelle d'oro per il periodo di tempo desiderato dell'esperimento. In seguito, la gelatina sposterà le nanoparticelle d'oro, creando delle tracce.

L'ultimo passaggio consiste nel monitoraggio e nella quantificazione della motilità cellulare mediante microscopia per acquisire le tracce create dalle cellule in movimento. Infine, le misurazioni dell'area delle tracce vengono effettuate utilizzando un software disponibile gratuitamente. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo, è che questo saggio richiede soltanto un microscopio ottico standard, una telecamera standard e l'utilizzo di un software di imaging disponibile gratuitamente.

Inoltre, il saggio consente facilmente l'analisi e il confronto di numerosi campioni utilizzando un metodo adatto allo screening ad alto rendimento. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'influenza di diversi fattori fisiologici e sul movimento cellulare, può essere applicato anche ad altri sistemi, come negli studi sugli effetti che i patogeni esercitano sulla motilità delle cellule infette. In generale, le persone alle prime armi con questa tecnica potrebbero incontrare difficoltà, poiché il metodo richiede di seguire rigorosamente i volumi e le temperature indicati nel protocollo.

In questo protocollo, viene posta particolare attenzione alla valutazione del colore della soluzione finale dei nanoparticelle d'oro precipitate per garantire il successo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi del saggio di motilità cinetica su tracce di FGO sono difficili da apprendere.

Contengono diverse procedure non comunemente utilizzate nei laboratori di biologia cellulare e molecolare. Per preparare coprioggetti rivestiti di gelatina, prima ri-sospendere la gelatina in acqua deionizzata per ottenere una soluzione con una concentrazione finale di 0,5 grammi ogni 300 millilitri, quindi sottoporre la miscela ad autoclave per 15-30 minuti. È importante eseguire questa operazione entro due ore dall'aggiunta della gelatina in un'appa da coltura tissutale.

Preparare i coprioggetti per il rivestimento trasferendo prima da otto a nove coprioggetti lavati con acido in una piastra di plastica da 100 millimetri. Assicurarsi che i coprioggetti non si tocchino tra loro né tocchino i lati della piastra. Pipettare con attenzione da due a tre gocce di gelatina su ciascun coprioggetto, evitando traboccamenti sulla piastra.

Quindi posizionare la piastra contenente i coverslip rivestiti con gelatina in un forno e cuocere a 90 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo 10 minuti, rimuovere la piastra dal forno e riportarla nella cappa per colture cellulari.

Aspirare delicatamente con pipetta qualsiasi eccesso di gelatina. Riporre la piastra in forno ed essiccare i vetrini a 70 gradi Celsius per 45 minuti. Una volta che i vetrini sono asciutti, rimuovere la piastra dal forno e riporla nell'incubatrice per colture cellulari.

Utilizzando delicatamente un ago sterile, sollevare un lato del vetrino. Successivamente, utilizzare pinzette sterili per rimuovere i vetrini rivestiti di gelatina dalla piastra e posizionarli in pozzetti separati di una piastra a 24 pozzetti. Il passaggio successivo consiste nel preparare i vetrini ricoperti di oro colloidale.

Iniziare preparando 10 millilitri di soluzione di citrato di sodio allo 0,5% lavorando in una cappa da coltura tissutale, combinando 1,5 millilitri di soluzione di acido clororico 14,5 millimolare e 13,5 millilitri di acqua deionizzata autoclavata in un matraccio erlenmeyer sterile privo di endotossine. Per ogni otto o nove coprioggetti, il risultato dovrebbe essere una soluzione leggermente giallastra. L'acido clororico è tossico e va manipolato con attenzione. È inoltre sensibile alla luce, pertanto il passaggio di ebollizione deve essere eseguito in condizioni di scarsa illuminazione.

Quando la soluzione ha raggiunto il punto di ebollizione, rimuovere il pallone dalla piastra riscaldante e trasferirlo su una piastra magnetica. Per formare le particelle colloidali d'oro in soluzione, aggiungere 0,7 millilitri della soluzione al 0,5% di citrato di sodio ogni 15 millilitri di soluzione di acido clororico mentre si agita, continuando a mescolare per circa due minuti. Durante questo periodo, la soluzione cambierà colore da giallo pallido a trasparente, poi a grigio, viola e infine viola scuro.

Prima che la soluzione raggiunga definitivamente un colore rosso vino o, preferibilmente, rosso ruggine, aspirare la soluzione di oro colloidale in una pipetta da 10 millilitri e lasciarla raffreddare nella pipetta per uno o due minuti, fino a quando non avrà raggiunto la temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere da 0,5 a 1 millilitro sopra le coprioggetti rivestite di gelatina nella piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra a 24 pozzetti contenente le coprioggetti ricoperte di oro colloidale in un incubatore a 37 gradi Celsius e incubare per 30 minuti. Dopo aver lasciato il tempo alle particelle di depositarsi sulle coprioggetti rivestite di gelatina, verificarne la densità al microscopio ottico.

La distribuzione appropriata delle nanoparticelle d'oro contribuisce a distinguere in modo semplice ed efficiente i margini dei percorsi solari. La densità ottimale varia in base alle dimensioni della cellula. Una concentrazione di particelle d'oro troppo elevata ostacola la capacità delle cellule di muoversi, mentre una concentrazione di particelle d'oro troppo bassa limita la possibilità di delineare un tracciato preciso della motilità.

Per questo motivo, in singoli esperimenti si devono utilizzare insieme solo coprioggetti prodotti nello stesso lotto o che sono stati selezionati per avere la stessa densità. Se la concentrazione delle particelle d'oro è insufficiente, aggiungere ulteriori da 0,5 a un millilitro di soluzione di oro colloidale sui coprioggetti rivestiti con gelatina. Tuttavia, se la concentrazione delle particelle d'oro è troppo elevata, come nel caso mostrato qui, l'unica scelta efficace è ripreparare la soluzione di oro colloidale e rivestire nuovi coprioggetti.

Se la densità delle particelle è corretta, reinserire la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius e incubare per un'ora fino a tutta la notte, quindi rimuovere le particelle d'oro non legate immergendo i cover slip tre volte in soluzione salina tamponata al fosfato sterile. Successivamente, conservare i cover slip rivestiti con oro colloidale in pozzetti contenenti PBS, all'interno di una piastra da 12 pozzetti pulita, a quattro gradi Celsius, fino al momento dell'utilizzo. I cover slip non devono mai asciugarsi e devono essere utilizzati entro due o tre mesi dalla data di preparazione.

Il passo successivo consiste nel preparare le lamelle rivestite con oro colloidale per la coltura cellulare. Posizionarle singolarmente in pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, nei quali siano stati aggiunti circa 0,3 millilitri di mezzo di coltura prima dell'inserimento delle lamelle. Trasferire da circa 5.000 a 50.000 cellule su ciascuna lamella rivestita con oro colloidale. Il numero di cellule varia in base al tipo cellulare, ma la densità deve essere sufficientemente bassa da evitare il sovrapporsi dei tracciati cellulari di più cellule nella stessa area.

Coprire la piastra e collocarla in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un periodo compreso tra sei e 24 ore. Sulla base della motilità del tipo cellulare, l'intervallo di tempo ottimale deve essere determinato sperimentalmente per ciascun tipo cellulare. Dopo l'incubazione, fissare eventuali coprivetri che non verranno analizzati immediatamente immergendoli due volte in PBS, seguito da incubazione in paraformaldeide al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente. Catturare immagini dei percorsi creati da una singola cellula in movimento su coprivetri non fissati o fissati. L'ingrandimento utilizzato per scattare le immagini dei percorsi cellulari varia a seconda del tipo cellulare. Tuttavia, lo stesso ingrandimento deve essere utilizzato per ogni studio al fine di poter confrontare i risultati.

Per i monociti, un ingrandimento di 40x funziona bene utilizzando software liberamente disponibili come Image, NIH Image o Image Tool per determinare l'area media di oro colloidale rimossa da 10 a 20 o più cellule per ogni campione a partire dalle immagini acquisite. Qui viene mostrato il percorso libero da particelle di oro colloidale da parte di un singolo monocita non stimolato, acquisito con un obiettivo 40x. Le cellule non mobili creano tracce caratteristiche di piccole dimensioni, a forma ovale o circolare, attorno a sé, indicando un livello basso di movimento. Al contrario, le cellule altamente mobili sono caratterizzate da un movimento direzionale con tracce allungate e aree complessive maggiori a causa delle loro forme irregolari.

I percorsi delle cellule vengono analizzati al meglio utilizzando lo strumento a mano libera nel software Image J per delineare il loro volume. Successivamente, è possibile effettuare misurazioni quantitative dell'area utilizzando lo strumento di misura nel menu di analisi di Image J. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di seguire scrupolosamente i volumi e le temperature indicati nel protocollo, poiché eventuali deviazioni possono influenzare fortemente i risultati finali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare coprioggetti rivestiti con gelatina, come preparare nanoparticelle d'oro e coprioggetti rivestiti con nanoparticelle d'oro, e come monitorare e valutare quantitativamente il movimento cellulare mediante microscopia ottica.

Non dimenticare che lavorare con soluzioni bollenti su un piastrino riscaldante, specialmente con i vapori provenienti dalla soluzione bollente di fluoro, acido AIC e citrato di sodio, può essere pericoloso; pertanto, precauzioni come lavorare sotto cappa ed esercitare il buon senso devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.