Profiling completa del regolamento dopamina nel substantia nigra e ventrale tegmentale Area

L'obiettivo generale di questa procedura è massimizzare l'informazione ottenuta dai riscontri molecolari associati alla regolazione della dopamina da un singolo campione di tessuto prelevato dalle regioni somatodendritiche del mesencefalo. Questo risultato si ottiene innanzitutto mediante un'accurata dissezione per separare la sostanza nigra dall'area ventrale tegmentale. Il secondo passaggio consiste nell'elaborare i tessuti per l'analisi della dopamina mediante HPLC e in un'ulteriore lavorazione della proteina endogena precipitata ai fini dell'analisi.

Successivamente, l'elaborazione della proteina precipitata per il contenuto totale di proteine consente di determinare quali proteine che regolano la dopamina o la fosforilazione proteica possono essere misurate in combinazione con la lettura del contenuto tissutale di dopamina nel campione. In definitiva, le analisi della dopamina e delle sue proteine regolatrici nelle regioni discrete del mesencefalo e nelle aree somatodendritiche permettono di trarre conclusioni sui meccanismi molecolari associati alla regolazione della dopamina.

Le monoammine influenzano molti esiti comportamentali, e infatti i ricercatori nel campo della tossicodipendenza, della biologia e dei disturbi della locomozione, come ad esempio il morbo di Parkinson, sono molto interessati a comprendere come monoammine come la dopamina, che studiamo nel mio laboratorio, influiscano sugli esiti comportamentali. Tuttavia, l'importanza dello studio delle monoammine può essere ulteriormente approfondita se comprendiamo come queste vengano regolate a livello molecolare. Il vantaggio della nostra tecnica è che possiamo ottenere, da un singolo campione prelevato da tessuto del sistema nervoso centrale, molteplici letture da quel medesimo campione, consentendoci così di ottenere un quadro completo di come gli eventi molecolari influenzino la disregolazione delle monoammine.

È possibile prendere questi dati e poi inserirli nel contesto dell'impatto sul comportamento. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo incontreranno difficoltà, poiché la determinazione della proteina e della fosforilazione richiede la conoscenza della quantità totale di proteina necessaria per un'analisi accurata, a seconda degli anticorpi scelti dal ricercatore. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Le tecniche di dissezione e la determinazione delle monoamine con le proteine regolatrici rappresentano un approccio relativamente nuovo per analizzare la regolazione in vivo. Per iniziare questa procedura, raffreddare la matrice cerebrale per roditore, una capsula di Petri contenente cinque lamette e un bisturi numero 11 su un letto di ghiaccio bagnato. Raffreddare inoltre su ghiaccio secco tutte le provette necessarie per la dissezione.

Successivamente, dopo aver sacrificato un ratto, rimuovere il cervello e posizionarlo capovolto in modo che il cervelletto laterale si adatti alle scanalature della matrice fredda di ghiaccio. Dopo un minuto, inserire le lame fredde nel cervello fresco, iniziando da circa due millimetri in senso rostrale rispetto al chiasma ottico per l'analisi del corpo striato e del nucleo accumbens. Proseguire quindi inserendo le lame fredde ogni millimetro fino a metà dei collicoli, quindi disporre le lame in modo sfalsato per facilitarne la rimozione dalla matrice.

Quando si estraggono i bisturi, cercare l'inizio dell'ippocampo poiché rappresenta la migliore guida per assicurare la presenza della sostanza nera (SN) e dell'area tegmentale ventrale (VTA) nel punto in cui l'ippocampo avvolge completamente il mesencefalo. Eseguire sezioni utilizzando la lama del bisturi numero 11 per dissezionare prima la SN dalla VTA. Rimuovere la corteccia e l'ippocampo sovrastanti.

Quindi effettuare un taglio verticale che separi l'area pigmentata della SN dalla VTA, assicurandosi che il rasoio mantenga un contatto costante con il ghiaccio durante la dissezione. Successivamente, eseguire un taglio orizzontale a livello o vicino alla linea mediana, appena al di sopra della parte più dorsale e laterale della sn. Infine, staccare delicatamente la SN dal resto del tronco encefalico.

Dopo aver rimosso la SN, isolare il VTA dal resto del mesencefalo. Posizionare immediatamente i tessuti dissecati nei microtubi pre-raffreddati. Successivamente, conservare i tessuti a meno 80 gradi Celsius fino al momento dell'elaborazione.

In questo procedimento, omogeneizzare delicatamente il tessuto immediatamente dopo il prelievo dal ghiaccio secco utilizzando una soluzione di acido perclorico 0,1 M e EDTA fredda con ghiaccio. Successivamente, riporre nuovamente il campione sul ghiaccio secco. Quindi, centrifugare i campioni a 12.000 giri/min per ottenere il sedimento.

Il pellet proteico da utilizzare per le determinazioni tramite western blot: aspirare successivamente i soprannatanti nel vial per HPLC. Posizionare i pellet proteici precipitati, ancora congelati, derivati dal trattamento con tampone HPLC, sul ghiaccio bagnato per farli scongelare e assicurarsi che tutto il tampone sia stato completamente rimosso e archiviato. Per l'elaborazione bilaterale della SN, aggiungere 300 microlitri di SDS al 1% contenente cinque millimoli di tris e un millimole di EDTA al pellet e sottoporre a sonica; per l'elaborazione bilaterale della VTA, sono sufficienti 200 microlitri di SDS al 1%.

Successivamente, inserire i campioni nell'acqua bollente per circa cinque minuti per completare la denaturazione delle proteine. Lasciarli quindi raffreddare a temperatura ambiente, assicurandosi che i tappi siano ben chiusi in questo passaggio. Utilizzare quindi il saggio BCA con una curva standard di proteina compresa tra due e 40 microgrammi di proteina.

Per determinare la concentrazione proteica nei campioni di cinque microlitri, utilizzare il valore mediano ottenuto da un'analisi triplicata per stabilire la quantità di proteina rispetto alla curva standard. Dividere il risultato per il volume del campione al fine di ottenere la concentrazione proteica. Successivamente, preparare i campioni con il buffer campione contenente DIO tre etolo per l'elettroforesi SDS in condizioni riducenti su gel di acrilamide al 10%, se necessario, come indicato dal colore del buffer campione.

Cambiare in giallo, aggiungere una soluzione di tris base 1 M a pH 8,2 in incrementi di 10 microlitri al campione fino a quando non appare il colore blu. Per verificare il pH corretto, eseguire la quantità appropriata di proteina totale mediante elettroforesi SDS-PAGE su gel di acrilamide al 10%, quindi trasferire le proteine su nitrocellulosa con dimensione dei pori di 0,45 micron. Impostare il contenitore elettroforico su almeno 27 volt e lasciare avvenire il trasferimento per tutta la notte.

Il giorno successivo, asciugare la membrana per almeno 30 minuti. Quindi colorarla con la soluzione di poncho S per circa cinque minuti. Successivamente, lavarla vigorosamente con soluzione di acido cloridrico 0,2% fino a quando le singole bande proteiche risultano ben distinte e la colorazione di fondo è stata rimossa.

Quindi ottenere un'immagine della colorazione del poncho S utilizzando ImageJ al fine di quantificare ulteriormente i carichi proteici relativi in ogni corsia e normalizzare i risultati di tirosina idrossilasi, trasportatore della dopamina o trasportatore vescicolare di ammine monoaminiche. Qui è mostrato il western blot della tirosina idrossilasi fosforilata Syrian 31 nei campioni di sostanza nera del ratto. La curva standard della tirosina idrossilasi fosforilata Syrian 31 calibrata varia da 0,3 nanogrammi a 2,0 nanogrammi ed è entro il range lineare di rilevamento. Qui è riportato il western blot della tirosina idrossilasi fosforilata Syrian 40 nei campioni di tegmento ventrale del ratto.

La curva standard di tirosina idrossilasi fosforilata SN 40 calibrata varia da 0,2 a 1,5 nanogrammi ed è compresa nell'intervallo lineare di rilevamento. È importante mantenere la temperatura corretta, così come etichettare le provette. È inoltre fondamentale normalizzare le proteine per ridurre la varianza dei risultati.

Questo protocollo, se seguito accuratamente, può fornire ai ricercatori nel campo della funzione locomotoria e dei comportamenti legati alla dipendenza ampie risposte molecolari relative alla regolazione dei monoamini nel cervello, in particolare della dopamina, che è l'aspetto di nostro interesse. Di conseguenza, queste risposte possono offrire un'analisi molto dettagliata e completa del significato in termini di esiti comportamentali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come massimizzare le risposte relative alla regolazione dei monoamini nella sostanza nera e nell'area tegmentale ventrale a partire da una singola dissezione tissutale.