Uso del mouse BLT umanizzato come cellule staminali basata su un Modello Tumore Terapia Genica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è generare topi portatori di un sistema immunitario umano ingegnerizzato. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando il topo per l'intervento chirurgico e successivamente caricando il trocar con un frammento di timo nel secondo passaggio. Il Matrigel viene mescolato con cellule transdotte CD34 negative e CD34 positive, e la miscela viene quindi aggiunta al trocar.

Successivamente, i costrutti di matrigel vengono trapiantati sotto la capsula renale. Infine, il rigetto dei tumori bersaglio da parte delle cellule T CD8 ingegnerizzate geneticamente può essere monitorato mediante imaging PET in vivo e misurazioni fisiche del tumore. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come i modelli completamente neuronali è che questo metodo consente lo studio dello sviluppo di cellule staminali umane modificate geneticamente all'interno del timo umano e la successiva valutazione dell'efficacia in vivo delle linee cellulari derivate. La procedura sarà dimostrata da tre tecnici dei nostri laboratori: Gregory Bristol, Bernard Levin e Sean Kim.

In questo schema, viene illustrato il modello BLT modificato utilizzato in questi studi per la generazione di topi chimera portatori di mart, un tipo specifico di linfociti T. L'impianto tissutale viene ricostruito a partire da cellule CD34 trasdotte e non trasdotte isolate da un fegato fetale autologo. Una frazione delle cellule trasdotte viene quindi congelata e iniettata nei topi irradiati da quattro a sei settimane dopo.

In questo video, viene mostrato l'impianto del costrutto th live una volta che gli animali sono diventati lenti a causa dell'anestesia. Iniziare rasando il lato sinistro di ciascun topo dalla spalla al fianco, tra il centro della schiena e l'addome. Dopo aver registrato il peso di ciascun animale, perforare le orecchie per l'identificazione numerica e iniettare sottocute 0,3 millilitri di carprofene in ciascuna delle loro spalle.

Quindi posizionare i topi sul fianco destro, rivolti verso sinistra. Ora risciacquare il trocar di un ago per impianto tumorale da 16 gauge con punta arrotondata utilizzando PBS. Utilizzando una pinza a becco lungo, aggiungere un pezzo di timo nella piastra contenente PBS e quindi tenere il trocar in posizione orizzontale con la sonda.

Aspirare il tessuto appena all'interno della punta. Far scivolare il trocar sotto la capsula renale e iniettare il tessuto è uno degli aspetti più complessi di questa procedura. Successivamente, farsi aiutare da un collaboratore.

Utilizzare una pipetta a spostamento positivo eend orph per mescolare cinque microlitri di matrigel freddo in un tubo di cellule con un delicato movimento di agitazione. Mantenere l'ago trocar in posizione orizzontale. Tirare lentamente indietro la sonda mentre l'assistente pipetta il matri gel.

Mescolare nel trocar per ogni topo. In primo luogo, detergere la cute nuda dell'animale con Betadine, quindi rimuoverlo con una salvietta imbevuta di isopropanolo. Individuare due volte il punto più scuro sotto la cute, che indica la posizione della milza.

Il rene si trova a circa cinque millimetri in posizione dorsale rispetto alla milza, utilizzando pinze a punta smussata per sollevare la pelle sovrastante il rene. Praticare un'incisione lunga circa 15 millimetri nella pelle, parallela alla milza. Eseguire un'incisione simile nel muscolo peritoneale sottostante.

Negli individui maschi, il rene dovrebbe essere direttamente visibile. È sufficiente premere sull'addome per farlo fuoriuscire. Mantenendo la pressione sull'addome con la mano sinistra per tenere il rene esposto, nelle femmine utilizzare prima un emostatico per afferrare l'ovaio e poi estrarre il rene per aiutare a mantenere l'organo all'esterno del corpo.

Aprire delicatamente un piccolo foro nell'estremità posteriore della capsula renale, quindi inserire il trocar in questo foro e farlo scivolare lungo il rene finché l'orifizio del trocar non sia completamente coperto dalla capsula renale. A questo punto, utilizzando il mignolo della mano destra, iniettare il tessuto. Ora usare l'emostatico chiuso per spingere delicatamente il rene nella sua posizione originale.

Fare un punto nel peritoneo con un doppio nodo, sollevando la pelle come un sacchetto, quindi applicare due clip da ferita. Infine, mettere una goccia di PBS su ciascun occhio e posizionare il topo di lato in una gabbia sopra la lettiera. Dopo aver impiantato tutti i topi nello stesso modo, verificare che gli animali siano tornati a sdraiarsi sulla pancia prima di lasciarli.

Questa prima figura mostra un'immagine rappresentativa dell'impianto vitale di TIM in topi umanizzati. In questa figura viene dimostrato lo sviluppo normale del tessuto timico e la distribuzione fisiologica del tessuto delle cellule T positive per CD quattro e CD otto umane. Dopo la ricostituzione, gli animali presentano un sistema immunitario umano con una distribuzione normale delle cellule T positive per CD quattro e CD otto.

Di seguito è mostrata un'immagine rappresentativa di un topo portatore di un tumore melanoma. Le aree grigie indicano l'immagine della scansione TC. Le aree colorate indicano l'attività metabolica del tumore rilevata mediante la scansione PET.

La scansione TC da sola in questo esperimento ha indicato una massa tumorale di grandi dimensioni nell'area indicata dal cerchio bianco. Tuttavia, come illustra l'imaging PET in vivo, questa zona consiste principalmente di tessuto necrotico e cicatriziale, evidenziando l'utilità dell'imaging PET come metodo più sensibile e accurato per valutare la regressione e l'eliminazione del tumore. Dopo questa procedura, altri saggi come quelli per i linfociti T, il fenotipaggio e l'attivazione ex vivo possono essere eseguiti per rispondere a domande relative alla funzione dei linfociti T.