Una procedura ottimizzata per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) Isolamento del Sistema Nervoso Autonomo progenitori neurali da organi viscerali di topi fetali

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere una popolazione di progenitori neuronali purificati a partire dai gangli del sistema nervoso periferico. Questo risultato si ottiene innanzitutto dissezionando l'organo o i gangli specifici di interesse da topi fetali. I tessuti vengono quindi parzialmente dissociati per liberare le singole cellule nel mezzo circostante.

Successivamente, la sospensione cellulare viene filtrata per rimuovere eventuali aggregati residui di tessuto o grandi grumi. Infine, la sospensione cellulare viene separata mediante citometria a flusso per isolare la popolazione cellulare di interesse in base all'espressione di un marcatore fluorescente in quella popolazione. In ultima analisi, i profili di espressione genica possono essere confrontati tra progenitori isolati in diverse fasi dello sviluppo o tra popolazioni purificate di diversi tipi cellulari neuronali.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'isolamento di popolazioni cellulari basato sull'etichettatura con anticorpi è che spesso non sono disponibili reagenti immuno. Linee di topi ingegnerizzate geneticamente che producono proteine fluorescenti in sottoinsiemi discreti di neuroni consentono l'isolamento di queste popolazioni cellulari. Sebbene dimostriamo questo metodo per l'isolamento di progenitori neurali dall'intestino e dalla traccia neurogena della bocca, esso può essere applicato anche ad altri sistemi modello che esprimono reporter fluorescenti.

Generalmente, chi è alle prime armi con questo metodo incontrerà difficoltà perché tende a digerire eccessivamente i tessuti di origine, causando una perdita della vitalità cellulare. Prima di iniziare la dissezione, osservare gli embrioni mediante illuminazione in campo chiaro per assicurarsi che le strutture di interesse siano a fuoco. Successivamente, identificare gli embrioni positivi per il transgene analizzando l'espressione del marcatore fluorescente mediante un microscopio stereoscopico a fluorescenza.

Dopo l'eutanasia, iniziare aggiungendo una minima quantità di PBS alla piastra per dissezione, in modo che l'embrione non galleggi mentre si dissecano i tessuti. Aprire la pelle dell'embrione lungo i lati del corpo e attraverso l'addome a livello del fegato. Ruotare l'embrione in posizione supina e utilizzare pinzette fini per fissarlo al suo posto.

A livello dell'arto anteriore, inserire un'altra coppia di pinze a livello del diaframma, quindi tirare energicamente. Trascinare gli organi interni verso la coda e lontano dalla parete corporea dorsale per rimuovere le viscere dal fegato fino al tubercolo genitale. Se eventuali organi della cavità toracica, come il cuore o i polmoni, fuoriescono attaccati alle viscere, rimuoverli prima di procedere ulteriormente.

Dopo aver separato le viscere addominali dalla carcassa, inserire una pinzetta al di sotto del fegato, in prossimità dello stomaco, e staccare delicatamente il fegato dall'intestino. Successivamente, dissezionare con cura l'intestino posteriore dall'uretra dorsale e rimuovere l'intestino dal tratto urogenitale. Infine, girare l'intestino in modo che la milza sia visibile al di sotto dello stomaco.

Rimuovere la milza e il pancreas. Separare i lembi dell'intestino tenendo il mesentere. Quindi rimuovere delicatamente il mesentere e la vascolarizzazione ad esso associata dall'intestino tirando dolcemente sul mesentere.

Evitare di tenere l'intestino direttamente con la pinzetta. Se l'intestino si rompe, unire semplicemente i pezzi separati nella fase di dissociazione. Riunire ogni tipo di tessuto in un tubo conico da 15 millilitri contenente HBSS ghiacciato, in base al tipo di tessuto e al fenotipo dell'embrione.

Dopo la centrifugazione, sottoporre i tessuti dissecati ad aspirazione per rimuovere il più possibile l'HBSS. Quindi risospendere il pellet di tessuto in uno o più millilitri di ACU max, cambiando la punta della pipetta tra ogni campione.

Per evitare contaminazioni incrociate tra i tipi di tessuto, collocare le provette in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 20-45 minuti. A seconda dello stadio del tessuto da isolare, la dissociazione e il filtraggio del tessuto rappresentano la parte più delicata della procedura, necessaria per prevenire una dissociazione eccessiva del tessuto e, di conseguenza, una bassa vitalità cellulare.

Limitare il tempo di dissociazione e non cercare di dissociare completamente tutti i frammenti di tessuto a metà del processo. Alla fine del tempo di dissociazione, spezzare manualmente il tessuto colpendo vigorosamente il tubo contro il bordo del bagnomaria e scuotendolo con un movimento rapido del polso. Trasferire subito i campioni dissociati sul ghiaccio e aggiungere immediatamente un millilitro di soluzione di arresto appena preparata in ciascun tubo, utilizzando una punta pipettatrice nuova per ogni campione; aspirare e dispensare il campione su e giù finché il tessuto non è quasi completamente dissociato.

Ora, utilizzando una pinzetta sterilizzata con etanolo, posizionare un quadrato di 3 centimetri di membrana in nylon da 38 micron sull'imboccatura di un nuovo tubo conico da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare punte a foro stretto per filtrare singolarmente la sospensione cellulare attraverso la membrana, pipettando al centro della stessa. Una volta filtrata la sospensione cellulare, risciacquare il tubo del campione con un millilitro di quench da uno a cinque e filtrare eventuali cellule rimanenti.

Quindi rimuovere la membrana avendo cura di evitare che campioni di tessuto non filtrati entrino nel tubo. Dopo la centrifugazione, asportare il soprannatante dalle sospensioni cellulari e risospendere il pellet in un millilitro di quench uno a cinque. Quindi filtrare ciascuna sospensione cellulare attraverso un setaccio in nylon in tubi in polistirene da cinque millilitri, come appena mostrato.

Cominciare prelevando un'aliquote piccola del campione di fluorescenza per il controllo di compensazione solo EGFP. Quindi dividere il campione di tessuto wild type in due porzioni, etichettandone una come solo wild type e l'altra come sette A a d.Solo. Ora riempire tutti i tubi del campione con quench da uno a cinque, e dopo la centrifugazione dei campioni aspirare tutto tranne gli ultimi 200 microlitri di supernatante in ciascun tubo.

Infine, aggiungere sette A a D ai campioni da ordinare e al controllo contenente solo sette A a D. Quindi aggiungere 0,75 millilitri di triazolo LS a una microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per iniziare la raccolta dei campioni, utilizzare i campioni di controllo per impostare i parametri di compensazione e i gate, in modo da escludere le cellule morte positive per sette A a D e raccogliere le cellule che mostrano un'intensa fluorescenza GFP.

Dopo aver impostato i parametri di compensazione, iniziare il sorting alla pressione più bassa possibile utilizzando un ugello largo e un flusso ridotto. Raccogliere al massimo 25.000 cellule in ogni provetta da microcentrifuga, in modo che il triol LS non venga eccessivamente diluito. Immediatamente dopo il sorting, vortexare ogni provetta contenente le cellule catturate nel triol ls.

In questa prima figura, viene mostrato un intero preparato del tratto genitale urogenitale a 15,5 giorni post-coito, osservato in vista ventrale con illuminazione in campo chiaro. Lo stesso campione viene osservato con illuminazione a fluorescenza per dimostrare la distribuzione delle cellule positive per EGFP nelle ghiandole surrenali e nei gangli celiaci di localizzazione mediale, identificati mediante l'espressione del transgene TH-EGFP. Questa vista laterale di una vescica sottoposta a dissezione subepidurale a 15,5 giorni post-coito TH-EGFP mostra fluorescenza derivante dall'espressione del transgene nei gangli pelvici, nella parete vescicale e nell'uretra.

In questa vista dorsale delle stesse cellule positive per EGFP sono evidenti nel tessuto dell'uretra dorsale anteriore; la dissociazione per produrre sospensioni cellulari per il sorting mediante citometria a flusso rappresenta un equilibrio delicato tra un'adeguata digestione enzimatica ed il rischio di sovradigestione, che può portare a basse variabilità cellulari. Queste microfotografie mostrano tessuti del tratto urogenitale inferiore e dell'intestino a metà del tempo di dissociazione. Come si osserva in queste immagini di tessuto digerito correttamente prima e dopo la procedura manuale, pezzi triangolari di organi sottoposti a dissezione sono ancora chiaramente visibili in tessuti trattati enzimaticamente per troppo tempo o con concentrazioni troppo elevate di enzima.

Tuttavia, la sospensione risultante non presenta alcun residuo di grandi frammenti di tessuto; una dissociazione adeguata e un filtraggio manuale producono profili di citometria a flusso che tipicamente mostrano oltre il 90% di cellule vitali, e in questa popolazione vitale, le cellule che esprimono il reporter mantengono un'espressione EGFP ad alta intensità. La popolazione nera è composta da cellule singole morte, marcate dall'assorbimento del colorante fluorescente seven a a d. La popolazione grigia è composta da cellule singole, identificate in base allo scattering anteriore e laterale, che escludono seven a a d e sono quindi vitali.

La popolazione verde proviene dell'area positiva per GFP selezionata mediante gating ed è composta da singole cellule vitali che hanno escluso il colorante seven AAD ed emettono fluorescenza EGFP. Con questa procedura, è possibile isolare progenitori neuronali da altri tessuti periferici come la catena simpatica, i gangli delle radici dorsali o i polmoni, al fine di indagare differenze nei profili di espressione genica tra popolazioni cellulari o lo sviluppo di linee cellulari distinte.