Multi-target Parallel Processing Approccio per Gene-to-struttura Determinazione della polimerasi Influenza PB2 subunità

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare un approccio multiplo per la determinazione strutturale di una proteina bersaglio mediante cristallografia a raggi X, partendo da un singolo gene o sequenza genetica, come nel caso presentato qui. La proteina bersaglio è la subunità polimerasica PB2 dell'influenza A, un componente chiave della replicazione virale. L'approccio multiplo viene realizzato progettando e clonando in parallelo una serie di costrutti genetici basati sulla singola sequenza bersaglio e su altre informazioni note riguardo alla proteina.

Il secondo passaggio consiste nel testare i livelli di espressione per ciascun costrutto e selezionare i migliori per l'espressione proteica su larga scala in coltura cellulare. Il passaggio successivo richiede l'apertura delle cellule per rimuovere le proteine bersaglio dal materiale di espressione e purificare ciascuna di esse ad altissimo grado di purezza. Vengono quindi impostati una serie di esperimenti di cristallizzazione per ciascuna proteina al fine di ottenere una forma cristallina adatta agli studi con raggi X.

Vengono quindi raccolti dati di diffrazione a raggi X ad alta risoluzione su uno o più cristalli e utilizzati per risolvere e affinare una mappa di densità elettronica che delinea la struttura di ciascuna proteina bersaglio. Questi risultati permettono di ottenere una struttura tridimensionale della proteina bersaglio basata sulla mappa di densità elettronica. L'elaborazione multiplo bersaglio aumenta notevolmente la probabilità di successo nella determinazione della struttura fornendo alternative praticabili ad ogni potenziale ostacolo lungo il percorso.

Lavorare su più bersagli in parallelo è anche molto efficiente, riducendo il tempo e il costo per proteina a ogni passaggio. La possibilità di aumentare la velocità con cui viene completata la determinazione della struttura per bersagli farmacologicamente rilevanti permetterà un numero maggiore di opportunità nello sviluppo di terapie ogni anno. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni preziose nella biologia strutturale, la proteina di alta qualità ottenuta attraverso questi approcci può supportare qualsiasi tipo di indagine basata sulle proteine.

Ogni fase del processo ha la sua specifica scienza e richiede competenze specialistiche, ma l'investimento in personale, strumentazione e know-how può ripagare ampiamente una volta che tutti i componenti sono stati assemblati. Una volta selezionato un gene bersaglio e il relativo prodotto genico per lo studio, il primo passaggio richiede la progettazione di molteplici varianti genetiche o costrutti. Un software di progettazione genica viene utilizzato per progettare questi costrutti a livello proteico, insieme al codice associato su sequenze geniche sintetiche ingegnerizzate.

Utilizzando il modulo visualizzatore di allineamento e il modulo di progettazione delle costruzioni, confrontare gli allineamenti delle sequenze proteiche e definire le costruzioni proteiche progettando inserti di primer PCR e primer terminali PCR per il vettore o gli ampers. Successivamente, utilizzare l'algoritmo da proteina a DNA di Gene Composer per effettuare la retro-traduzione di ciascuna sequenza di aminoacidi in una sequenza nucleotidica ingegnerizzata. Utilizzare la tabella appropriata di codoni per ottimizzare la sequenza all'espressione in una specifica linea cellulare.

In questo caso, batteri e coli. Una volta che la sequenza del gene bersaglio è pronta, clonare virtualmente e inserire il gene in un plasmide vettore adatto per l'espressione batterica. In questo caso, un vettore PET 28 modificato.

Questo vettore contiene alcuni componenti necessari per l'espressione e la purificazione delle proteine. Il gene bersaglio viene modificato per incorporare una sequenza codificante un marcatore di istidina all'estremità N o C della proteina e una sequenza di scissione che permette la rimozione del marcatore durante la purificazione. Il vettore possiede inoltre un gene di resistenza agli antibiotici per i test di espressione e per la fermentazione.

Ogni sequenza genetica della proteina bersaglio viene quindi creata mediante metodi standard di sintesi genica in preparazione per il pipe cloning, noto anche come polymerase incomplete primary extension cloning, o pipe cloning, una strategia di clonaggio basata sulla PCR in cui il gene bersaglio viene amplificato con primer complementari al vettore previsto. Questo metodo sfrutta la natura incompleta della PCR in fase avanzata, che lascia i prodotti della PCR con estremità a singolo filamento variabili. Preparo la PCR dell'inserto o IPCR aggiungendo cinque microlitri di primer diretto e cinque microlitri di primer inverso a ciascuna reazione.

In una piastra a 96 pozzetti, in base alla mappa della piastra, aggiungere due microlitri di ciascun gene sintetico completo nel rispettivo pozzetto secondo la mappa della piastra. Dopo aver aggiunto 25 microlitri di miscela master PFU a ciascun pozzetto, eseguire 25 cicli delle reazioni utilizzando le seguenti condizioni di PCR. Denaturare a 95 gradi Celsius per 30 secondi.

Anilare a 50 gradi Celsius per 45 secondi ed estendere a 68 gradi Celsius per tre minuti. L'amplificazione del frammento viene confermata mediante analisi su gel AGROS dei prodotti IPCR. I prodotti IPCR di successo sono rappresentati da bande intense.

Risultati meno desiderabili sono spesso osservabili come bande deboli o strisciate in una reazione separata. Il plasmide di espressione viene amplificato mediante PCR del vettore o la conferma dell'amplificazione del frammento VPCR avviene tramite analisi su gel AROS dei prodotti VPCR. Una volta amplificati i prodotti IPCR e VPCR, questi vengono aggiunti a una piastra di fusione e inseriti in un termociclatore per la reazione di fusione.

I costrutti clonati con successo vengono quindi trasformati in cellule di e coli competenti dal punto di vista chimico e conservati in stecche di glicerolo per iniziare la serie di test di espressione. Una piccola quantità di ciascun campione proveniente da una scorta di glicerolo del costrutto clonato viene posta su una piastra di agar separata. La piastra è preparata con brodo nutriente batterico e il marcatore antibiotico Kanamicina codificato nel vettore, e viene incubata tutta la notte a 37 gradi Celsius per il giorno successivo.

Avviare una precoltura per ogni campione prelevando una singola colonia dalla piastra di agar appena cresciuta. Utilizzare questa colonia per inoculare 1,2 millilitri di brodo TB integrato con canamicina e glucosio per l'elaborazione in parallelo. Ogni precoltura viene coltivata in un blocco da 96 pozzetti con fondo rotondo.

Coltivare per tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione a 220 rotazioni al minuto. Dopo la crescita notturna, avviare colture di induzione su piccola scala per ogni campione utilizzando 40 microlitri della precoltura per inoculare.

1,2 millilitri di brodo TB, integrato con 50 milligrammi per millilitro di canamicina e sistema Express Novagen. Coltivare le colture di induzione a 20 gradi Celsius per 48 ore, agitando a 220 giri al minuto; raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 4.000 unità di forza di gravità per 15 minuti.

Versare il soprannatante e conservare i pellet a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora prima di ulteriori lavorazioni dopo la purificazione. Analizzare la proteina con e senza reazione di scissione mediante elettroforesi capillare utilizzando un sistema Caliper Lab CHIP 90 secondo il protocollo del produttore. Nel caso della sottounità PB2 della proteina dell'influenza A, 14 dei 34 costrutti hanno prodotto una proteina bersaglio solubile ed sono passati al passaggio successivo di fermentazione su larga scala.

Per avviare una fermentazione su larga scala, inoculare 100 millilitri di brodo per coltura batterica contenente 50 milligrammi per millilitro di can micina da una stock di glicerolo e coltivare per tutta la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, agitando a 220 giri al minuto, espandere la precoltura utilizzando 10 millilitri per inoculare.

Un litro di brodo contenente mezzo di induzione automatica e 50 milligrammi per millilitro di canamicina in un matraccio da due litri con lamelle. Agitare le colture in espansione a 37 gradi Celsius circa ogni 30 minuti. Verificare la densità ottica della coltura misurando l'assorbanza UV a una lunghezza d'onda di 600 nanometri.

Quando si raggiunge una densità ottica di 0,6, al termine del tempo di crescita desiderato, modificare la temperatura dell'incubatore agitatore portandola a 20 gradi Celsius. Prelievo di un Ali quad rappresentativo di 10 millilitri da ciascun costrutto per il test di espressione. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 5.000 unità di forza G per 15 minuti.

Versare il soprannatante e congelare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius. Per iniziare questa procedura, scongelare e risospendere la pasta cellulare nel buffer di lisi in un rapporto di volume di uno a cinque. Agitare vigorosamente per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Utilizzare una spatola pulita per staccare i grumi dal lato del becher. Lisare meccanicamente le cellule sul ghiaccio con un sonicator a ultrasuoni. Clarificare il lisato grezzo mediante centrifugazione a 18.000 unità di forza G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.

Recuperare il soprannatante e conservare un'aliquote piccola per l'analisi prima di procedere con la purificazione su larga scala. Confermare l'espressione proteica su larga scala di ogni coltura mediante analisi su gel SDS-PAGE. Questo risultato rappresentativo dell'SDS-PAGE mostra un'espressione proteica robusta, una solubilità di circa il 50% e un'escissione pari a circa il 50%.

In questo caso, il marcatore istidinico è stato rimosso insieme a un marcatore di solubilità proteica aggiunto, progettato nel costrutto originale. La resina a base di nichel viene utilizzata per separare la proteina bersaglio, dotata del marcatore unico di istidina, da tutti gli altri materiali cellulari, inclusi le proteine batteriche native. Una colonna di nichel viene preparata lavandola con quattro volumi di colonna di acqua UE per rimuovere il tampone di conservazione, seguiti da un volume di colonna di tampone B e da cinque volumi di colonna di tampone.

La parallelizzazione dell'equilibrazione A per E viene eseguita con il protein maker, che è in grado di far funzionare più colonne contemporaneamente. Caricare ciascun lisato chiarificato contenente la proteina solubilizzata con il tag di istidina su una colonna separata a una velocità di due millilitri al minuto, seguito da diversi lavaggi con volumi di colonna di tampone A; raccogliere il flusso in uscita e conservarlo per l'analisi. Eluire la proteina legata mediante una serie di gradienti a step con i tamponi A e B al 95-5, 60-40 e infine al 100% di tampone B. I componenti del tampone B competono con l'istidina per la resina al nichel e quindi rimuovono la proteina dalla colonna a un dato rapporto.

Raccogliere ogni frazione di eluizione separatamente. Qui viene mostrato un risultato rappresentativo di un cromatogramma ottenuto in una corsa su una colonna al nichel. Analizzare le frazioni eluite al nichel, il lisato grezzo, il lisato chiarificato e il flusso passante al nichel mediante elettroforesi SDS-PAGE e confrontarli con l'assorbanza UV a 280 nanometri raccolta durante la purificazione su colonna.

Questo passaggio determina se la purificazione è stata eseguita con successo. Selezionare e raggruppare le frazioni contenenti la proteina bersaglio da utilizzare per ulteriori elaborazioni. Calcolare la quantità totale di proteina a questo stadio mediante il coefficiente di estinzione teorico della proteina, misurando l'assorbanza UV a 280 nanometri e considerando il volume totale delle frazioni raggruppate.

Conservare un piccolo campione per l'analisi. Il gene per la proteina bersaglio era codificato con una sequenza specifica, riconosciuta dalla proteasi ULP1 come sito di scissione; pertanto, l'aggiunta di ULP1 determina la scissione tra il marcatore istidinico e la proteina di interesse. Per iniziare questa procedura, aggiungere un microlitro di proteasi simile all'ubiquitina, uno per ogni cinque milligrammi di proteina presente nelle frazioni raggruppate.

A questo punto, la proteina scissa viene trasferita dal buffer B al buffer A per ulteriori elaborazioni utilizzando della pellicola per dialisi; dializzare la proteina contro due litri di buffer A per quattro ore a quattro gradi Celsius sotto agitazione. Utilizzare un cutoff di peso molecolare di 10 chilodalton per PB due dopo la dialisi. Eseguire un'altra corsa elettroforetica su gel SDS-PAGE della proteina bersaglio in presenza e in assenza di ULP uno.

Questo determinerà se la scissione da parte di ULP one è avvenuta con successo e permetterà la selezione delle migliori frazioni da utilizzare per ulteriori elaborazioni. Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi del gel SDS-PAGE per tre costrutti della polimerasi pb. Nel primo pozzetto sono presenti marcatori del peso molecolare di due subunità.

Le corsie due, sei e dieci contengono proteine aggregate da colonne al nichel uno. Le corsie tre, sette e undici contengono il flusso passante della proteina scissa nel buffer A proveniente dal nichel due, mentre le corsie quattro, otto e dodici mostrano la rimozione del tag dell'istamina nel buffer B proveniente dal nichel due.

Dopo la rimozione dell'istamina, le frazioni raccolte dal secondo nickel vengono concentrate. Per iniziare la cromatografia a esclusione molecolare (SEC), è necessario scegliere nuovamente la resina appropriata in base al peso molecolare del bersaglio. In questo caso, si utilizza una colonna acere S 110 over 30 GL, che viene equilibrata con 200 millilitri di tampone SEC a un flusso di 0,5 millilitri al minuto. Utilizzando una siringa da cinque millilitri, caricare il campione in un loop campione da 10 millilitri e avviare la corsa sulla colonna SEC. Monitorare il cromatogramma di assorbanza UV a 280 nanometri raccogliendo frazioni di piccolo volume.

Eseguire tutte le frazioni SEC pertinenti mediante elettroforesi SDS-PAGE. L'approccio standard per i test di cristallizzazione delle proteine viene effettuato con il metodo della goccia sospesa che prevede la diffusione di vapore. È comune impostare due o più schermate a matrice sparca fin dall'inizio per ciascuna proteina bersaglio.

Per iniziare questo processo, riempire preliminarmente ogni serbatoio di una piastra di cristallizzazione compatta da 96 pozzetti con 80 microlitri di ciascuna condizione presente nella schermata di cristallizzazione selezionata; dispensare 0,4 microlitri di proteina nel buffer SEC in ciascuno dei 96 pozzetti. Quindi aggiungere 0,4 microlitri della schermata di cristallizzazione, assicurandosi di mescolare completamente la goccia in ogni pozzetto. Coprire l'intera piastra con nastro trasparente per cristalli, garantendo una sigillatura completa di ogni pozzetto, e conservare la piastra a 16 gradi Celsius in un luogo privo di vibrazioni ambientali e non soggetto a disturbi.

Controllare periodicamente la cristallizzazione della proteina nelle prossime settimane al microscopio stereoscopico. Se non compaiono cristalli proteici, impostare nuove piastre con condizioni diverse e variare la concentrazione della proteina nella goccia finale per aumentare la probabilità di successo prima del raccolto. Raffreddare un puck di tipo ALS in un contenitore riempito con azoto liquido e coprirlo con un coperchio per iniziare il raccolto.

Tagliare il nastro trasparente che copre il pozzetto con il cristallo della proteina bersaglio e spostarlo in un pozzetto vuoto vicino. Aggiungere 1,6 microlitri della corrispondente condizione di cristallizzazione e combinarli con 0,4 microlitri di glicole etilenico. Una soluzione contenente il 20% di glicole etilenico nella condizione di cristallizzazione protegge il cristallo della proteina.

Durante il congelamento criogenico, analizzare il cristallo al microscopio e selezionare un'adeguata anellino criogenico per il raccolto, abbinando il diametro interno dell'anellino alla larghezza massima del cristallo. Fissare l'anellino criogenico a un'asta magnetica per cristalli e prelevare direttamente il cristallo dalla soluzione del pozzetto. Immergere immediatamente l'anellino criogenico con il cristallo raccolto in un crioprotettore, quindi immergerlo in un puck di tipo LS.

Per congelare rapidamente, ripetere il congelamento del cristallo per un numero desiderato di cristalli. Una volta completato il raccolto, utilizzare una bacchetta per portacrystal per posizionare un coperchio magnetico sul portacrystal contenente i cristalli congelati rapidamente con linguette piegate. Capovolgere il portacrystal per il passaggio successivo.

Avvitare un espulsore sul disco, quindi trasferire il disco sul KU actor doer e utilizzarlo per rimuovere il coperchio. I cristalli presenti nel disco rimangono congelati in un bagno di azoto liquido fino al momento dell'analisi di diffrazione a raggi X mediante il software di acquisizione immagini J Director. Impostare i seguenti parametri per la schermatura del cristallo: fessura del fascio a 0,5 gradi, distanza del rivelatore di 50 millimetri, passo dell'immagine di 70 gradi e durata dell'esposizione di 30 secondi.

Di seguito è mostrata un'immagine di esempio del software di acquisizione durante lo screening di un cristallo; il pannello centrale mostra la diffrazione a raggi X osservata da un cristallo rappresentativo, con raccolta di un numero sufficiente di immagini ad alta risoluzione per ottenere un set completo di dati necessario alla determinazione della struttura tridimensionale. Le strategie di clonaggio e purificazione proteica illustrate in questo video hanno portato all'ottenimento di 14 campioni purificati di PB due, di cui nove hanno prodotto cristalli adatti agli studi di diffrazione. Il set di dati di diffrazione a raggi X è stato raccolto in laboratorio su cinque dei nove costrutti, utilizzando radiazione QK alpha e un generatore di raggi X con anodo rotante Rigaku Super Bright FRE Plus, equipaggiato con ottiche Ossec VariMax HF e un rivelatore CCD Saturn 944 Plus.

Viene mostrata qui un'immagine di diffrazione a raggi X della subunità PB2 della polimerasi. Ogni dataset è stato elaborato e sono state determinate complessivamente quattro strutture della subunità PB2. Ogni struttura è stata sottoposta a revisione paritaria e caricata nel Protein Data Bank per l'accesso pubblico.

Questa figura mostra diagrammi a nastro delle molecole nell'unità asimmetrica cristallografica. Delle quattro strutture di PB due, le strutture secondarie sono colorate con un modello arcobaleno con i corrispondenti codici PDB. In questa tabella è riportata l'analisi dei risultati per le proteine bersaglio PB due dell'influenza ottenuti mediante i metodi descritti in questo articolo video.

La pipeline di elaborazione parallela multi-obiettivo per la determinazione della struttura a partire dal gene è illustrata in cinque fasi: clonaggio, solubilità, purificazione, cristallizzazione e determinazione della struttura. L'output della nostra pipeline di biologia strutturale non fornisce soltanto le basi per ricerche basate sulla struttura, ma alimenta anche ulteriori studi, come saggi funzionali per confermare l'attività proteica o schermature biofisiche di nuovi composti mediante MAR o SPR, al fine di identificare nuovi punti di partenza per lo sviluppo di farmaci. Questa tecnica e gli strumenti sviluppati insieme ad essa hanno contribuito ad aprire la strada ai biologi strutturali verso molteplici indagini di tipo scoperta, inclusa la progettazione di farmaci basata sulla struttura, che ha avuto un impatto notevole sulla salute umana e sulle malattie.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come l'elaborazione parallela multi-target possa aumentare notevolmente il successo della determinazione strutturale. Non dimenticare che lavorare in un laboratorio di biologia strutturale può essere estremamente pericoloso e che le opportune precauzioni, come l'uso dei DPI, devono essere sempre adottate durante le attività di laboratorio.