Misurazione degli effetti degli anticorpi sulla funzione cellulare di cardiomiociti isolati

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare gli anticorpi cardiocinetropi nel plasma di pazienti affetti da cardiomiopatia dilatativa o da altre malattie cardiache con base autoimmune. Questo viene ottenuto mediante un'immunoassorbimento iniziale su colonne di sferosilice rivestite con anti-IgG per purificare l'immunoglobulina G come secondo passaggio. I cardiomiociti ventricolari vengono isolati da ratti Wistar adulti, fornendo la base cellulare per questo saggio biologico.

Successivamente, si lascia che i cardiomiociti aderiscano agli slip di copertura della camera e vengano colorati con URA 2:00 AM al fine di consentire l'osservazione del transitorio intracellulare di calcio durante le contrazioni; quindi, si testa l'IgG del paziente per osservarne l'effetto sulla contrattilità del cardiomiocita. I risultati indicano se l'IgG di un paziente contiene anticorpi trofici, in base alle variazioni osservate nella contrattilità e nel transitorio di calcio nei cardiomiociti isolati. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi immunitari standard per il rilevamento di anticorpi, è che essa è indipendente da un antigene specifico e permette di discriminare tra anticorpi stimolanti e quelli bloccanti.

La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Google e riceverà assistenza tecnica dal nostro laboratorio. Per iniziare la procedura, preparare le colonne mini di immunosorbimento riempiendo tre millilitri di sferos anti-IgG per ogni due millilitri di plasma del paziente con EDTA in una colonna vuota Econopak. Successivamente, posizionare un filtro sulla sommità dei sferos anti-IgG.

Tagliare l'estremità inferiore della colonna e premere il filtro per ottenere un flusso di circa una goccia al secondo. Quindi lavare la colonna tre volte con un volume di plasma di cloruro di sodio 0,9%, pipettando il plasma nella colonna quando il plasma si è completamente immerso nell'anti IgG Spheros. Lavare con lo stesso volume di cloruro di sodio 0,9%. Successivamente, pipettare un volume di plasma di glicina cloridrato 0,2 molare a pH 2,8 nella colonna e lasciarlo penetrare nel phos.

Quindi aggiungere un altro volume di cloridrato di glicina alla colonna. Raccogliere il flusso in un tubo da 15 millilitri e portare il pH a 7,3 utilizzando cloridrato di tris 0,5 molarità a pH 8,0 per rigenerare la colonna. Lavare con tre volumi di plasma di cloridrato di glicina dopo un lavaggio finale con due volumi di cloruro di sodio 0,9%.

La colonna può essere utilizzata per il successivo campione di plasma destinato all'uso su cardiomiociti. La frazione di IgG raccolta deve essere dializzata contro il buffer sperimentale riempiendo innanzitutto la frazione di IgG in un tubo di dialisi in membrana di estere di cellulosa con cutoff di peso molecolare a 100 chilodalton. Successivamente, inserire il tubo in un litro di EB e agitare lentamente con un agitatore magnetico a quattro gradi Celsius. Dopo otto ore, trasferire il tubo di dialisi in tre litri di EB fresco e dializzare per ulteriori 20 ore a quattro gradi Celsius dopo la dialisi.

Fare bollire il campione per 30 minuti a 57 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Per inattivare i fattori del complemento, determinare la concentrazione totale di IgG e preparare aliquote contenenti ciascuna 330 microgrammi di IgG. In questa procedura, preparare il buffer di isolamento privo di calcio secondo il manoscritto allegato.

Quindi riempire il serbatoio superiore di un sistema di perfusione lanor termostatato con 80 millilitri di IB e mantenere il tampone a 37 gradi Celsius, aerandolo con 95%ossigeno, 5%anidride carbonica per 30 minuti. Sciogliere circa 7.000-10.000 unità di collaghenasi di tipo due e 174 milligrammi di BSA priva di acidi grassi in 20 millilitri. IB contenente cloruro di calcio 112,5 micromolare e regolare il pH del tampone di isolamento nel serbatoio superiore se necessario.

Successivamente, anestetizzare un ratto Wistar del peso di 175-200 grammi utilizzando tiopentale a 375 microgrammi per chilogrammo, con l'aggiunta di 2.500 UI di eparina alla soluzione di tiopentale. Dopo la toracotomia, escindere con cura il cuore mantenendo integro l'arco aortico e trasferirlo in cloruro di sodio allo 0,0 percento freddo in ghiaccio, contenuto in cloruro di sodio freddo in ghiaccio. Rimuovere dal cuore il sangue e i tessuti circostanti.

Quindi trasferirla in una soluzione fresca di cloruro di sodio allo 0,9% ed esporre l'aorta. Accendere il riduttore di flusso del sistema langor per ottenere una velocità di gocciolamento di due-tre gocce al secondo. Successivamente, fissare il cuore alla cannula.

Perfusione per un massimo di tre minuti con un flusso di una goccia al secondo per eliminare il sangue residuo. Successivamente, far circolare l'IB nel sistema LOR. A questo punto, rimuovere 20 millilitri di tampone dal serbatoio superiore.

Riempire il serbatoio con la soluzione di collaghenasi e ricaricare tanta soluzione tampone quanta è necessaria per raggiungere 80 millilitri. Quindi, far circolare la soluzione di digestione per altri 27 minuti. Successivamente, staccare il cuore dalla cannula.

Rimuovere gli atri e l'aorta, quindi tritare i ventricoli in piccoli pezzi. Far scorrere il buffer di digestione nel serbatoio inferiore. Ridurre il volume a un massimo di 40 millilitri per digerire ulteriormente i ventricoli tritati per 10-15 minuti sotto aerazione continua con 95%ossigeno, 5%diossido di carbonio.

Successivamente, filtrare la sospensione cellulare attraverso una garza con dimensione della maglia di 200 micron in un tubo da 50 millilitri. Infine, ripristinare il contenuto di calcio delle cellule centrifugando la sospensione cellulare a 40 3G per due minuti. A temperatura ambiente, risospendere le cellule in 10 millilitri.

IB contenente cloruro di calcio 200 micromolare, centrifugare nuovamente e risospendere le cellule in 10 millilitri. IB con cloruro di calcio 500 micromolare. Dopo una centrifugazione finale, risospendere i cardiomiociti in EB sterile filtrato a una densità di 50.000 cellule per millilitro.

Rivestire i vetri coprioggetto in una piastra a quattro pozzetti con 10 microgrammi di laminina per pozzetto e attendere fino a quando non sarà completamente asciutta. Quindi aggiungere un millilitro di sospensione di cardiomiociti in ciascun pozzetto. Utilizzando una micropipetta con la punta tagliata e lasciando le cellule aderire per un'ora a temperatura ambiente, diluire 10 microlitri della soluzione stock di fira 2:00 AM a un milligrammo per millilitro in cinque millilitri di eb e mantenere la soluzione di colorazione al buio.

Successivamente, rimuovere il tampone e le cellule non attaccate dai vetrini, pipettando 0,5 millilitri della soluzione di colorazione. In ogni pozzetto, incubare le cellule per 10 minuti sotto agitazione moderata. Successivamente, rimuovere la soluzione di colorazione e lavare le cellule una volta con un millilitro di EB.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di EB in ogni pozzetto in questa procedura, posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza invertito collegato a un sistema di registrazione del calcio e della contrattilità dei miociti. Posizionare un elettrodo su misura con un tubo di influx e un tubo di influx nel primo pozzetto e nel super. Fondere i cardiomiociti con 1 millilitro al minuto di EB.

Avviare la stimolazione elettrica a 20 volt, 1 hertz e una durata di cinque millisecondi per impulso, e lasciare che le cellule si adattino alla stimolazione per circa due minuti. Selezionare un cardiomiocita a forma di bacillo integro, con striature ben visibili e contrazione costante, e posizionarlo al centro del campo visivo. Quindi aprire il canale della telecamera ed orientare la cellula in posizione orizzontale all'interno dell'area video ruotando l'adattatore di fissaggio della cellula e spostando il tavolo del microscopio.

Regolare il limite degli elementi di controllo di rilevamento dell'area video. Accendere il canale fluorescente e registrare da 10 a 15 contrazioni per ottenere l'accorciamento cellulare iniziale e il transitorio del calcio. Successivamente, spegnere il canale della luce del microscopio per evitare lo sbiancamento della colorazione fluorescente.

Passare il flusso da EB al bypass del campione mediante una valvola a tre vie e fusare i cardiomiociti con un millilitro di IgG del paziente. Fermare la pompa poco prima che l'aria raggiunga la pozzetta, accendere il canale della luce e registrare altre 10-15 contrazioni per ottenere la risposta acuta della cellula. Quindi mettere in pausa la registrazione e spegnere nuovamente il canale della luce; ripetere le registrazioni dopo due e cinque minuti ed estrarre l'elettrodo dalla pozzetta al termine delle operazioni. Analizzare l'accorciamento cellulare e il transitorio del calcio mediante il software Ion Wizard, utilizzando rispettivamente la lunghezza del bordo/lunghezza e la finestra del rapporto numerico sottratto URA2.

Successivamente, calcolare le variazioni percentuali delle risposte acute, a due minuti e a cinque minuti, rispetto all'accorciamento cellulare iniziale e all'altezza massima del transiente del calcio. Di seguito è riportato un esempio rappresentativo della misurazione di controllo. L'accorciamento cellulare e il transiente del calcio sono stati monitorati in tempo reale prima della superfusione con IgG e immediatamente a due minuti e a cinque minuti dalla superfusione con IgG.

Ecco un esempio della misurazione di un campione di IgG contenente anticorpi cardio-depressivi. L'accorciamento cellulare e il transitorio del calcio sono stati misurati in tempo reale prima della superfusione con IgG e immediatamente a due e cinque minuti dalla superfusione con IgG. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione su come rilevare gli anticorpi cardio-depressivi nel plasma del paziente misurandone l'effetto sull'accorciamento cellulare e sul transitorio del calcio nei cardiomiociti adulti isolati.