Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in

Lo scopo di questa procedura è analizzare le funzioni cerebrali superiori. In un modello semplice, la larva DFA mediante appetito, apprendimento olfattivo associativo. Questo viene ottenuto raccogliendo innanzitutto 30 larve del terzo stadio alimentate da un contenitore di cibo.

Successivamente, i larvi vengono addestrati per cinque minuti in una piastra di Petri con fruttosio come ricompensa e un contenitore di odore su ciascun lato contenente un ottanolo come stimolo olfattivo. Quindi viene effettuata una seconda fase di addestramento della durata di cinque minuti su una piastra senza ricompensa di fruttosio e con contenitori di odore su ciascun lato contenenti acetato di amile. Dopo tre ripetizioni delle due fasi di addestramento, i larvi vengono esposti a contenitori di odore posti su lati opposti per un test della durata di cinque minuti senza ricompensa.

In definitiva, la preferenza odorosa relativa di un ottanolo rispetto all'acetato di amile indica che le larve di drosophila possono formare un'associazione tra stimoli olfattivi e ricompensa zuccherina, e questo può essere utilizzato per studiare l'apprendimento associativo in un sistema geneticamente malleabile. Questo metodo, in combinazione con l'interferenza genetica della funzione neuronale, può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'apprendimento e della memoria, come quali sono i neuroni che segnalano la ricompensa, o quali sono i neuroni necessari o sufficienti per l'acquisizione o il recupero di un ricordo ripetitivo? A dimostrare la procedura sarà anti a postop.

Uno studente dottorando del mio laboratorio prima prepara delle piastre di Petri con aros al 2,5% senza fruttosio. Per preparare le piastre con fruttosio, aggiungere il fruttosio all'aros disciolto e quindi versare il composto nella piastra. Successivamente, etichettare ciascuna di queste piastre con un simbolo diverso che renda cieco l'esperimentatore.

La piastra contenente il fruttosio è la ricompensa condizionata, mentre la piastra semplice è l'assenza di ricompensa. Per gli stimoli condizionati, preparare un totale di tre contenitori personalizzati in teflon per odori, ciascuno con 10 microlitri di uno ottole puro. I coperchi presentano dei piccoli fori che permettono l'evaporazione dell'odore.

In secondo luogo, preparare altri tre contenitori per odore con 10 microlitri di acetato di amile diluito uno a 50 in olio di paraffina. Questa diluizione è attraente quanto i 10 microlitri di uno ottile puro; iniziare raccogliendo 30 esemplari, alimentandoli, senza farli vagare. Terzo, prelevarli da un flacone di cibo.

Questo protocollo può essere eseguito in qualsiasi momento della giornata. È indipendente dai ritmi circadiani. Trasferire la lava in una piastra di Petri contenente alcune gocce di acqua del rubinetto e spostarla delicatamente avanti e indietro con un pennello.

Quindi trasferire la lava in una seconda piastra di Petri che contiene anche alcune gocce di acqua di rubinetto. Esaminare le larve per verificare la presenza di pasta alimentare sulle pareti del corpo. Posizionare ora la piastra di Petri nell'apparato sperimentale per addestrare le larve ad associare odori a una specifica coda di zucchero.

Posizionare un contenitore di odore sul lato sinistro e su quello destro di uno dei due tipi di piastra utilizzati per gli stimoli. Qui si usa un odore ottanoico, ma la scelta è arbitraria poiché l'esperimentatore è cieco rispetto alla ricompensa. Successivamente, posizionare il gruppo di larve al centro della piastra.

Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti mentre gli animali sono esposti agli stimoli. Assicurarsi che le larve riescano a superare la tensione superficiale della goccia d'acqua in modo da non rimanere intrappolate e possano esplorare liberamente. Posizionare un nuovo contenitore di acetato di Amal su una piastra di Petri pulita.

Dopo cinque minuti, utilizzare un pennello umido per trasferire le larve su un piatto di tipo opposto con stimoli opposti posizionati sui lati sinistro e destro. L'odore qui è acetato di amile. Una volta trasferite le larve, chiudere il coperchio e lasciare che gli animali esplorino per cinque minuti.

Quando questo tempo è trascorso, il primo ciclo di addestramento è completato. Eseguire altri due cicli di addestramento nello stesso modo del primo, trasferendo gli animali con un pennello umido ed esponendoli a ciascuna combinazione di stimoli e ricompense per un totale di tre volte.

Per il test sperimentale, posizionare contenitori di odore freschi, uno per ogni stimolo, su lati opposti di una piastra di Petri in agar non rivestita. Trasferire gli animali addestrati al centro della piastra. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti.

Dopo cinque minuti, utilizzare un modello posizionato sotto la piastra che definisca chiaramente tre zone della piastra: sinistra, destra e centrale; contare il numero di larve in ciascuna zona. La zona centrale rappresenta un punteggio di mancata preferenza e rende l'analisi più rigorosa e meno soggetta a bias. Infine, per completare l'esperimento, selezionare 30 nuove larve di terzo stadio in fase di alimentazione e ripetere la procedura di addestramento e prova con la combinazione opposta di ricompensa e stimoli.

Continuare a utilizzare gli stessi contenitori per gli odori. Sono necessari diversi test di controllo per determinare se gli animali transgenici presentano un normale processamento degli odori in risposta agli stimoli premianti. Il test per la preferenza odorosa nei soggetti naïve inizia con la raccolta e il lavaggio di 30 larve, come effettuato per la fase di addestramento e di prova.

Successivamente, posizionare i larvi su una piastra di Petri Agro Rose con un solo vial di stimolo su un lato. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti. In seguito, utilizzando il modello, contare il numero di larvi sul lato vicino, al centro e sul lato opposto della piastra rispetto allo stimolo.

Eseguire questo test per ogni stimolo utilizzato nell'esperimento per verificare la preferenza innata per lo zucchero. Preparare delle piastre di Petri dimezzate tagliando a metà l'agar di una piastra circolare e riempiendo lo spazio vuoto con agar fuso dell'altro tipo. Prestare attenzione affinché le due metà siano uguali in volume e non formino un bordo ben definito.

Questo potrebbe richiedere pratica con la piastra divisa a metà preparata e a temperatura ambiente, posizionando 30 larve naive al centro della piastra, precedentemente pulite dall'alimento. Mettere un terzo di stella marina tra le larve al centro della piastra. Chiudere il coperchio e attendere cinque minuti.

Successivamente, utilizzando il modello, contare il numero di larve su ciascun lato e contare quelle al centro. La procedura descritta è stata utilizzata per addestrare e testare la lava trenchgenica. Utilizzando gli stimoli di esempio, i dati sono stati registrati come numero di larve in diverse regioni delle piastre di Petri.

Dopo cinque minuti fuori da questa preferenza di dati, sono stati calcolati gli indici e gli indici di prestazione sono stati ricavati da gruppi addestrati in modo reciproco. Poiché le larve testate erano transgeniche, è stata offerta anche una scelta tra un contenitore odoroso pieno e aria, oltre a una scelta tra aromi puri e aromi più zucchero. Un'analisi degli indici calcolati mediante diagramma a scatola (box plot) ha rivelato che gli animali erano in grado di imparare a distinguere un odore acetato di ottile dall'acetato di metile utilizzando aromi a base di fruttosio come rinforzo appetitivo.

Gli animali hanno riconosciuto entrambi gli stimoli come attrattori e hanno mostrato una preferenza innata per l'aroma di fruttosio rispetto all'aero. Questo paradigma sperimentale è stato utilizzato con successo con una vasta gamma di stimoli olfattivi e visivi, nonché con una grande varietà di stimoli premianti e avversivi. Questo paradigma, combinato con le numerose potenti manipolazioni genetiche disponibili in Drosophila, è particolarmente utile per analizzare reti neurali; ad esempio, manipolando geneticamente specifici insiemi di neuroni, definiti dai pattern di espressione di Gal4, è possibile valutare i ruoli funzionali di tali neuroni nell'apprendimento dell'appetito.

Seguendo questa procedura, insieme all'interferenza genetica della funzione neuronale, è possibile analizzare le reti neurali del cervello larvale coinvolte nell'apprendimento e nella memoria. A causa della semplicità del cervello larvale, questo può essere ottenuto fino al livello della singola cellula.