Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare, caratterizzare e differenziare le cellule staminali del polso gentile umano da denti permanenti utilizzando due metodi. Ciò viene ottenuto raccogliendo denti del giudizio inclusi sani, tagliandoli intorno alla giunzione cemento-smalto all'inizio. Le cellule staminali polinucleari dentali (D PSCs) vengono isolate mediante due metodi diversi.

Nel primo metodo, i tessuti polipoidi vengono digeriti enzimaticamente mediante incubazione in collaghenasi di tipo uno più soluzione per lo spazio interdiscale. Qui li chiamiamo ed. Per quanto riguarda il metodo di isolamento nel secondo metodo, i tessuti palp vengono semplicemente posti nel fiasco senza alcuna digestione.

In questo modo, le dpss iniziano a migrare dal tessuto nel flacone. Queste cellule, denominate OG, fanno riferimento al metodo di isolamento per outgrowth. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'identificazione delle cellule staminali mediante citometria a flusso.

Il terzo passaggio della procedura è l'induzione della differenziazione degli odontoblasti, e l'ultimo passaggio consiste nella valutazione comparativa della differenziazione degli odontoblasti tra due gruppi mediante colorazione rossa e QBCR. Sono RA Kde del Dipartimento di Cellule Staminali e Biologia dello Sviluppo presso l'Istituto Rian. Oggi vi mostrerò l'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione comparativa di cellule staminali mesenchimali umane utilizzando due metodi.

Ciao, sono il dottor Rezaian dell'Istituto Rio. Stiamo lavorando a un progetto relativo alle cellule staminali della polpa dentale umana. Queste cellule sono un tipo di cellule staminali mesenchimali, facili da ottenere con dolore e morbosità minima.

Le cellule staminali meccie si caratterizzano per la loro capacità plasica, la formazione di colonie e la capacità di differenziazione multipotente. Salve, sono la dottoressa Ami del Dipartimento di Cellule Staminali. Nel nostro istituto, utilizziamo questa procedura in laboratorio per isolare le cellule staminali ai fini di studi di ricerca e applicazioni future.

In medicina rigenerativa, il primo passo per utilizzare questa fonte di cellule staminali per future terapie basate su cellule staminali consiste nello scegliere il miglior protocollo per l'isolamento delle cellule staminali dal tessuto parodontale umano. Per raggiungere questo obiettivo, è fondamentale indagare alcuni aspetti del comportamento cellulare in diverse condizioni di isolamento delle cellule staminali. Per prima cosa, procederò all'isolamento di cellule staminali del polso dentale umano utilizzando l'una o l'altra metodica: la dissociazione enzimatica del polso o l'espansione delle cellule staminali da impianti di tessuto.

Quindi caratterizzarli e differenziarli in blastocisti. Cominciamo. Per prima cosa, spazio e collagenasi di tipo uno vengono sciolti in PBS.

Quindi filtrarli utilizzando un filtro da siringa da 0,2 micron. Raccogliere entrambi in un tubo conico. Poi aggiungere pener e PBS per ottenere la concentrazione finale.

Trasferire i denti del giudizio sani in laboratorio nel mezzo basico freddo, in condizioni sterili. Pulire la superficie del dente con etanolo al 70% prima dell'analisi. Assicurarsi di rimuovere ogni traccia di polvere dalla superficie del dente.

Tagliare il dente intorno alla giunzione smalto-cementizia utilizzando un disco dentale sterilizzato per esporre la camera pulpare. È necessario considerare che il processo di taglio deve essere eseguito lentamente per ridurre il surriscaldamento del tessuto dentale. Successivamente, separare delicatamente il tessuto pulpare dalla corona, riducendo il tessuto pulpare in pezzi di uno-due millimetri con la lama di Scarpa.

Trasferire piccoli pezzi di tessuto pulpare in un millilitro di soluzione enzimatica per un'ora a 37 gradi Celsius, vorticosando ogni 30 minuti per favorire la disgregazione del tessuto pulpare. Successivamente, rimuovere gli aggregati più grandi facendoli passare attraverso un filtro cellulare da 70 micron. Quindi aggiungere PBS contenente PENER e centrifugare a 1.200 giri al minuto per cinque minuti.

Rimuovere con attenzione il soprannatante. Quindi sospendere la piastra nel mezzo di proliferazione pm, trasferirla nel flacone di coltura e aggiungere il mezzo. Quindi incubare.

Cambiare il mezzo ogni tre giorni fino al raggiungimento della confluenza cellulare per il metodo di outwork. Ripetere il processo di taglio. Dopo il taglio, porre i tessuti in frammenti di uno-due millimetri.

Quindi posizionarli nella coltura. Aggiungere il mezzo di proliferazione, esporre brevemente e incubare. Si deve considerare che il volume totale del mezzo di proliferazione deve favorire l'adesione di tutti i frammenti per la successiva espansione cellulare.

Cambiare il mezzo dopo aver osservato l'espansione cellulare e successivamente ogni tre giorni fino al raggiungimento della confluenza cellulare. Per l'immunofenotipizzazione, incubare entrambi i tipi di D PSCs con anticorpi coniugati a PE o FITC per 30 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Quindi aggiungere PBS e centrifugare a 1.200 giri al minuto per cinque minuti.

Rimuovere il soprannatante e risospendere, sospendere la piastra in PBS e infine valutare i marcatori di superficie mediante citometria a flusso sottocolturando entrambi i tipi di DPC per tre passaggi. Quindi trattare con tripsina a ghiaccio e trasferirli in sei piatti di coltura rossi al 60% di confluenza, sostituendo il mezzo di coltura (PM) con mezzo odontogenico. Tre pozzetti vengono mantenuti come controllo negativo aggiungendo PM.

Cambiare il mezzo ogni tre giorni; al giorno 21° lavare le cellule con PBS. Quindi fissarle con un millilitro per pozzetto di gel al 10% per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo 15 minuti, rimuovere con attenzione il fissativo e risciacquare le cellule tre volte con acqua distillata. Quindi sostituire l'acqua con un millilitro per ogni alza rossa in soluzione di colorante rosso. Dopo 20 minuti, rimuovere l'eccesso di colorante e lavare le cellule quattro volte con acqua deionizzata.

Quindi aggiungere un millimetro di acqua per pozzetto per evitare che le cellule si secchino. Dopo la colorazione, si possono osservare tre rotaie superiori diventare rosse rispetto ai controlli al microscopio; con un ingrandimento elevato è possibile vedere l'assorbimento del colore di colorazione attorno alla cellula, per la quantificazione della colorazione rossa. Dopo aver rimosso l'acqua, aggiungere un millilitro per pozzetto di acido acetico al 10%, quindi incubare per 30 minuti con agitazione.

Quindi, rimuovere delicatamente le cellule dalla piastra utilizzando un raschietto per cellule. Successivamente, trasferirle nei tubi separati. VOR agita vigorosamente per 30 secondi.

Quindi riscaldarli a 85 gradi Celsius per 10 minuti. Per evitare l'evaporazione, sigillare le provette con ParaView e trasferire il campione sul ghiaccio per cinque minuti; quindi centrifugarlo a 20.000 ×g per 15 minuti. Nel frattempo, preparare la diluizione seriale standard di rosso Congo secondo il protocollo della regione.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante e trasferirlo nei nuovi tubi. Neutralizzare il pH con idrossido di ammonio al 10%. Quindi aggiungere gli standard e i campioni nella piastra a 96 pozzetti.

Piastrare in una piastra a pozzetti, quindi misurare l'assorbanza a 405 nanometri e analizzare i dati in base alla diluizione seriale standard. Qui è possibile osservare le DPC, isolate mediante dissociazione enzimatica al giorno 10°, 15° e 18°, e anche le DPC espanse al giorno 5°, 10°, 13° e 18°. Entrambi i tipi di dpss nel sase tre sono quasi delle stesse dimensioni e morfologia. I risultati dell'immunofenotipizzazione mostrano la presenza di marcatori delle cellule staminali mesenchimali come CD 44, CD 73 e CD 19, e l'assenza di marcatori ematopoietici ed endoteliali come CD 34, CD 45 e CD 11 B. In modo interessante, l'espressione di CD 1 0 5 e CD 146 è maggiore nelle d PSC espanse rispetto alle D-P-S-C-E-D. La quantificazione della colorazione enzimatica rossa al giorno 21° della differenziazione in odontoblasti mostra un maggiore deposito di calcio nelle D-P-S-C-E-D rispetto alle cellule staminali dentali senza trattamento.

I risultati di QPCR indicano anche espressioni significativamente più elevate di MEP e A LP come marcatori di mineralizzazione nel D-P-S-C-D rispetto alle cellule staminali dentali in uscita. Nel frattempo, entrambi i geni sono regolati durante la differenziazione e anche l'espressione di DSPP, come marcatore odontogenico, aumenta durante il processo differenziativo. Tuttavia, non vi è alcuna variazione significativa nell'espressione di DSVP nelle cellule differenziate tra i gruppi ED e OG.

Abbiamo appena mostrato come isolare cellule staminali da tessuti dentali umani mediante la dissociazione enzimatica della polpa o la migrazione spontanea di cellule staminali da espianti di tessuto. Questo è tutto. Vi auguriamo buona fortuna nel provare a utilizzare questa procedura nei vostri esperimenti.

Grazie.