Preparazione di linee cellulari per Knockdown condizionale dell'espressione genica e valutazione degli effetti sulla Knockdown E4orf4 morte cellulare indotta

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare l'effetto dell'abbattimento di ACF one o SNF two H sulla morte cellulare indotta da E four or four. Questo viene ottenuto generando linee cellulari in cui l'espressione di srna per ACF one o SNF two H viene attivata in modo condizionale mediante l'aggiunta di doxiciclina, portando a una riduzione dei livelli della proteina ACF one o SNF two H come secondo passaggio. Le cellule delle linee cellulari ottenute vengono trattate con doxiciclina per ridurre l'espressione di ACF one o SNF two H oppure non vengono trattate.

Successivamente, E4orf4 è espresso nelle cellule in presenza o assenza di ACF1 o SNF2h resistenti all'ShRNA. Per indagare l'effetto di ACF1 o SNF2h sulla morte cellulare indotta da E4orf4, si ottengono risultati che mostrano l'impatto dei livelli di ACF1 o SNF2h sulla tossicità di E4orf4, basati sul conteggio dei nuclei con morfologia apoptotica mediante il saggio JY. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la transfezione transitoria di RNA, è che tutte le cellule esprimono l'ShRNA e la percentuale di cellule che co-esprimono insieme al plasmide tradizionale è più elevata. Questo metodo fornisce informazioni sui meccanismi alla base della morte cellulare indotta da E4orf4, ma può essere applicato anche allo studio di altre proteine pro-apoptotiche.

Oltre ad Ana Lafe, un ricercatore del mio laboratorio dimostrerà alcune parti di questa procedura. Per iniziare la procedura di generazione di linee cellulari inducibili, piastrare le cellule T-Rex 2 9 3 a una densità di circa cinque volte 10 alla sesta cellule per piastra da 10 centimetri in otto millilitri di DMEM contenente siero privo di tetraciclina e cinque microgrammi per millilitro di blaster, quindi incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, sostituire il mezzo con otto millilitri di mezzo fresco prima della trasfezione. Il plasmide per la trasfezione è il plasmide P superior neo plus GFP che codifica ACF uno o SNF due H-S-H-R-N-A, sotto il controllo di un promotore H uno inducibile alla tetraciclina, nonché il gene di resistenza alla neomicina fuso al GFP e controllato da un promotore costitutivo PGK.

Aggiungere 10 microgrammi di DNA plasmidico a 500 microlitri di cloruro di sodio 150 millimolare ed eseguire un vortex. Successivamente, aggiungere il reagente jet PY a due microlitri per microgrammo di DNA in un altro tubo contenente 500 microlitri di cloruro di sodio 150 millimolare ed eseguire un vortex. Aggiungere la soluzione jet pie al DNA e mescolare accuratamente mediante vortex.

Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo 15 minuti, pipettare delicatamente i complessi di DNA sulle piastre da 10 centimetri contenenti una confluenza del 70-80%. Le cellule T-Rex 2 9 3 saranno mischiate il giorno seguente.

Sostituire il mezzo con un mezzo selettivo, in questo esempio DMEM come in precedenza, contenente 500 microgrammi per millilitro di G quattro 18. Per le prossime due settimane, monitorare le cellule. Sostituire il mezzo selettivo con un mezzo fresco simile ogni tre o quattro giorni fino a quando non compaiono le colonie.

Individuare le colonie ad occhio nudo e segnarne la posizione sul fondo della piastra utilizzando un pennarello colorato. Verificare al microscopio che le colonie siano ben separate. Le colonie possono essere isolate una volta che sono abbastanza grandi da essere visualizzate senza microscopio.

Per il successo di questa procedura, è importante scegliere colonie ben separate durante l'isolamento delle colonie. In una cappa sterile, aspirare il mezzo dalla piastra. Risciacquare delicatamente con PBS ed aspirare completamente tutto il liquido rimanente.

Aggiungere tre microlitri di tripsina al 0,25% in EDTA a una colonia sulla piastra, pipettando ripetutamente la tripsina fino a quando le cellule si staccano dalla piastra. Trasferire le cellule in mezzo selettivo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Ripetere l'operazione per diverse altre colonie sulla piastra.

Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica fino a quando non riempiono il pozzetto. Successivamente, suddividere le cellule di ciascuna colonia originale in tre pozzetti ciascuna, in una piastra separata a 12 pozzetti e incubare tutta la notte il giorno seguente. Sostituire il mezzo in una piastra con mezzo contenente un microgrammo per millilitro di doxiciclina, proveniente da una soluzione stock preparata in acqua bidistillata.

Sostituire il mezzo in una piastra di controllo con mezzo senza doxiciclina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 72 ore. Le cellule di una pozzetta trattata e di una non trattata vengono quindi raccolte per l'analisi tramite western blot per determinare l'efficienza dell'abbattimento di ACF uno o di SNF due H; qui viene mostrato un risultato rappresentativo.

Questo blot è stato colorato con anticorpi contro SNF due H e tubulina alfa. Quest'ultima funge da controllo di caricamento per le due linee cellulari. Le linee numero quattro e numero cinque hanno mostrato una forte riduzione di SNF due H dopo l'induzione con doxiciclina e sono pertanto state scelte per l'utilizzo nell'esperimento di silenziamento genico, che verrà illustrato nel prossimo segmento.

Le cellule non trattate nella terza piastra verranno utilizzate per espandere la linea cellulare selezionata e aliquote di tali cellule saranno successivamente congelate. Per un uso successivo per indurre il knockdown di ACF uno o SNF due cellule H in mezzo selettivo in piastre da 10 centimetri, aggiungere la doxiciclina a una concentrazione di un microgrammo per millilitro in metà delle piastre e incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per 48-72 ore. Ogni gruppo di piastre dovrà fornire cellule per 12 piastre da sei centimetri, compresi due duplicati per il saggio DPI per ciascun punto, oltre a una piastra per l'analisi tramite western blot di ciascun campione.

Da 48 a 72 ore dopo l'induzione, staccare le cellule di ciascun gruppo mediante tripsinizzazione e, dopo averle contate, seminare 1,5 volte 10 alla sesta cellule per piastra da sei centimetri nel mezzo identico, con o senza doxiciclina. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica, durante la notte; il giorno seguente, trasfettare le cellule come indicato.

Sia le cellule non trattate che quelle trattate con doxiciclina vengono trasfettate in triplice replicato in quattro modi diversi. Un primo con un plasmide vuoto e un plasmide che esprime GFP; un secondo con il plasmide vuoto insieme a un vettore che esprime ACF1 resistente allo SHRA-GFP o SNF2-HGFP; un terzo con un plasmide che codifica per E4 o E4Δ; e un quarto con un plasmide che esprime GFP e con il plasmide che codifica per E4, tutti e quattro. Successivamente alla trasfezione, incubare tutte le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per tutta la notte.

Il giorno successivo alla trasfezione delle cellule, estrarre le proteine da una piastra per ogni campione per l'analisi tramite Western blot, al fine di verificare che ACF one o SNF two H siano stati efficacemente ridotti e che E four or four sia stato espresso in modo equivalente nei diversi campioni. Le rimanenti 16 piastre saranno utilizzate per il saggio DPI. Aspirare il mezzo dalle piastre destinate al saggio DPI e lavare delicatamente le cellule con PBS in una cappa chimica.

Aggiungere un millilitro di paraformaldeide al 4% preparata in PBS per coprire le cellule e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente senza agitazione. Aspirare la paraformaldeide e lavare con PBS agitando a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi; dopo il terzo lavaggio con PBS, aggiungere etanolo al 80% conservato a meno 20 gradi Celsius e incubare a meno 20 gradi Celsius per almeno un'ora.

Aspirare l'etanolo e lavare le cellule due volte con PBS agitando a temperatura ambiente per cinque minuti ogni volta; successivamente, lavare una volta per cinque minuti a temperatura ambiente con PBS contenente 0,5% BSA e 0,05% tra 20 o P-B-S-B-T. Eseguire anche questo lavaggio con agitazione per prevenire il legame non specifico degli anticorpi. Bloccare le cellule in un millilitro di tampone P-B-S-B-T contenente 10% di siero di capra per 20 minuti, agitando a temperatura ambiente.

Quindi lavare le cellule due volte in P-B-S-B-T, per cinque minuti ogni lavaggio. Incubare le cellule con l'anticorpo primario, in questo caso un anticorpo specifico per E quattro o quattro, in un millilitro di P-B-S-B-T per un'ora sotto agitazione a temperatura ambiente. Quindi lavare due volte in P-B-S-B-T e una volta in PBS contenente lo 0,1% di BSA, per cinque minuti ogni lavaggio.

Successivamente, aggiungere alle cellule un millilitro di PBS con lo 0,1% di BSA contenente l'anticorpo secondario marcato con fluorocromo appropriato e 0,5 microgrammi per millilitro. Concentrazione finale di DPI, incubare per 40 minuti agitando a temperatura ambiente al buio. Infine, lavare con PBS per cinque minuti.

Aspirare il pozzetto ed esporre le piastre capovolte per un'ulteriore ora fino alla notte successiva per ottenere una completa essiccazione; coprire quindi con vetrini protettivi in alluminio montati con soluzione Flora Mount G. Conservare le piastre a quattro gradi Celsius al buio fino al momento del conteggio. Le cellule con nuclei apoptotici sottoposte ai vari trattamenti descritti nel protocollo sono state fissate e colorate con anticorpi specifici E4/6 e DPI per visualizzare i nuclei delle cellule transfezionate.

Questa figura mostra un esempio di cellule che esprimono E four or four e GFP. Il pannello A mostra l'espressione della proteina GFP di controllo da sola, e il pannello B mostra l'espressione di E four or four. I nuclei colorati con DAPI sono mostrati nel pannello C e le immagini sovrapposte sono mostrate nel pannello D. Le frecce bianche indicano cellule trasfettate con GFP ed E four or four contenenti nuclei con morfologia apoptotica. Le frecce rosse indicano nuclei con forme irregolari che non sono considerati nuclei apoptotici; l'asterisco indica nuclei mitotici o nuclei appena divisi. Il numero di nuclei condensati o frammentati visualizzati mediante colorazione con DAPI è stato contato per calcolare la percentuale di nuclei con morfologia apoptotica all'interno della popolazione cellulare trasfettata, al fine di mantenere un'ottimale obiettività del test.

Il conteggio dei nuclei apoptotici nei vari campioni è stato effettuato in modo cieco, in cui la persona che effettuava il conteggio non conosceva l'identità dei campioni. Un risultato rappresentativo è mostrato in questo grafico. Percentuali più elevate di anomalie nucleari sono state osservate nelle cellule esprimenti E4/4, confermando che E4/4 induce la morte cellulare. La percentuale più alta di anomalie nucleari è stata osservata nelle cellule esprimenti E4/4 in cui i livelli di ACF1 sono stati ridotti mediante silenziamento mediato da SHRNa, indicando che il silenziamento di ACF1 potenzia la morte cellulare indotta da E4/4, aumentando la tossicità di E4/4 nelle cellule.

Esprimendo bassi livelli di ACF, uno non derivava da un aumento dei livelli di E quattro o quattro come osservato nel Western blot. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di facilitare un conteggio accurato dei nucleoli apoptotici con DPI e di applicare criteri rigorosi per l'identificazione di questi nucleoli. Oltre a questa procedura, altri metodi come i saggi clonogenici possono essere eseguiti per convalidare i risultati del DA pse a seguito di questa procedura.

Altri metodi, come i saggi di co-immunoprecipitazione, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive. Ad esempio, se esiste un'interazione fisica tra le proteine in esame.