Analisi Imaging di Neuron Interaction Glia in Platform Cultura Microfluidic (MCP) a base di Axon neurone e glia co-cultura di sistema

Questo protocollo stabilisce una nuova piattaforma di coltura cellulare condivisa tra assoni neuronali e astrociti per analizzare le interazioni tra neuroni e astrociti mediante imaging ad alta risoluzione. In primo luogo, assemblare la camera di coltura microfluidica, preparare le colture neuronali e indurre gli assoni neuronali a penetrare nel lato opposto del MCP. Successivamente, aggiungere astrociti coltivati per stabilire un sistema di coltura condivisa compartimentalizzato; i risultati, inclusi imaging a intervalli di tempo con microscopia confocale a immunofluorescenza, possono contribuire a comprendere le interazioni tra assoni, astrociti e assoni neuronali.

L'idea per questo metodo è nata quando abbiamo cercato di separare l'effetto del processo neuronale rispetto alla secrezione neuronale nella regolazione del GT. In genere, le persone nuove rispetto al metodo incontrano difficoltà nell'indurre l'assone in un'altra parte del compartimento cellulare. È richiesta un'alta densità di neuroni sani piastrati sul lato neuronale, con i neuroni posizionati vicino ai canali centrali.

Le camere aperte MCP sono progettate per colture compartimentalizzate di diversi tipi di cellule; rivestimenti in poliuretano e laminina sono necessari per la semina di neuroni e astrociti nella coltura co-colturale. Inizialmente, applicare una soluzione di poliuretano da un milligrammo per millilitro alle piastre con fondo in vetro sterile e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Lavare le piastre con fondo rivestito tre volte con acqua doppio-distillata e quindi posizionarle sotto una cappa sterile per farle asciugare.

Successivamente, ricoprire la piastra con laminina ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro e asciugare sotto luce UV per un'ora. L'assemblaggio di MCP sulla piastra con fondo in vetro deve essere preparato fresco prima dell'uso. Posizionare la piattaforma di coltura microfluidica con i canali di collegamento centrali sul lato inferiore e formare una sigillatura stretta con il vetro ricoperto.

Piatti inferiori. Aggiungere il mezzo di coltura standard per neuroni o astrociti su entrambi i lati del MCP assemblato. Incubare la camera da due a quattro ore a 37 gradi Celsius e verificare l'assenza di perdite tra il MCP e il vetro.

Piatto inferiore. Colture cellulari di neuroni corticali sono appena state preparate da cervelli di topi embrionali di 14-16 giorni. Dopo la dissezione del cervello del topo, rimuovere le meningi dalla corteccia sotto il microscopio stereoscopico.

Usare una lametta per trinciare il tessuto in piccoli blocchi di tessuto e posizionare i blocchi tritati in un tubo dopo la centrifugazione. Eliminare il mezzo sovrannatante rispetto al pellet e aggiungere 0,05% Try per 10 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Dissociare le cellule mediante pipettaggio delicato con una pipetta Pasteur a punta fiammeggiata.

Filtrare il campione attraverso un setaccio da 70 micron per raccogliere una sospensione cellulare neuronale chiara utilizzando la piastratura neuronale. Mezzo integrato con 5% di FBS per la semina. 150 microlitri di neuroni sul lato destro della piastra MCP assemblata.

Un'elevata densità di neuroni, poiché soltanto i neuroni che si attaccano nell'area di ritenzione cellulare sono in grado di far crescere assoni attraverso i canali centrali fino all'altro lato del MCP assemblato. Il giorno successivo, aspirare con attenzione il mezzo dall'area di semina cellulare della camera e sostituire il mezzo di semina per neuroni con il normale mezzo di coltura per neuroni.

Medio, aggiungere 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dai glia, o GDNF, al lato degli astrociti della camera. Questo crea un gradiente chimico che aiuterà a indurre la fuoriuscita degli assoni dal lato neuronale attraverso i canali centrali del MCP assemblato. Due giorni dopo, monitorare la presenza di assoni che entrano nel canale centrale.

Una volta che gli assoni entrano nel canale centrale, di solito raggiungono l'altro lato entro un giorno. Gli assoni rimangono normalmente integri per almeno una settimana dopo aver raggiunto l'altro lato. Dissociato il cervello da P uno a tre topi, si seminano astrociti in piatti di poliuretano da 10 centimetri.

Coltivare, le cellule ricambiano il mezzo di coltura degli astrociti una volta al giorno per i due giorni successivi, quindi una volta ogni tre giorni dopo sette giorni, quando gli astrociti hanno formato un monolayer confluenziale al 90%. Raccogliere le cellule mediante tripsina. Circa cinque giorni dopo che i neuroni sono stati seminati, aspirare il GDNF. Quindi seminare 150 microlitri degli astrociti risospesi nel lato sinistro del MCP assemblato. Quando gli assoni stanno per entrare o sono appena entrati, dopo la riseminazione degli astrociti, gli assoni che entrano nel lato sinistro del MCP assemblato interagiscono direttamente con gli astrociti, sia mediante contatto assiale diretto sia mediante il rilascio di fattori solubili.

Monitorare gli astrociti per verificarne l'adesione all'area di ritenzione cellulare. Immunoistocolorare le cellule nel sistema di co-coltura compartimentalizzato per visualizzare proteine specifiche coinvolte nell'interazione tra assoni e astrociti. Il sistema di co-coltura di neuroni e astrociti compartimentalizzato permette esclusivamente ai processi neuronali, in particolare agli assoni, di interagire selettivamente con gli astrociti.

Qui descriviamo l'attivazione trascrizionale indotta dagli assoni del trasportatore del glutammato negli astrociti. Questi studi utilizzano topi transgenici, che ospitano l'espressione di un reporter fluorescente EGF sotto il controllo del promotore genomico GT uno. Una densità elevata di neuroni viene coltivata nell'area di ritenzione cellulare del MCPA assemblato; la vista ingrandita mostra gli assoni che attraversano i canali centrali e penetrano nel lato opposto, con la colorazione per la tubulina beta tre che rivela il cono di crescita dell'assone.

Il sistema MCP permette il monitoraggio dei fasci assonali mentre crescono attraverso il canale centrale e raggiungono l'altro lato. La colorazione immunoistochimica per GT one identifica gli astrociti nel lato gliale del sistema MCP. L'immagine mostra il contatto tra assoni e astrociti positivi per GLT one.

L'espressione del reporter EGFP si correla con l'attivazione del promotore endogeno di GT one, con l'espressione proteica e con l'attività funzionale. La valutazione dell'attività del promotore di GT one in singoli astrociti in C two mostra una immunoreattività significativamente aumentata per GLT one nel sistema di co-coltura compartimentalizzato. In modo importante, il sistema MCP permette acquisizioni di immagini in time-lapse per monitorare i cambiamenti dinamici.

Ad esempio, questi dati mostrano l'attivazione del promotore GT uno indotta dagli assoni con retro GT uno EGFP astrociti e neuroni di tipo selvaggio un giorno dopo la semina degli astrociti. Minima fluorescenza EGFP viene osservata. L'intensità EGFP aumenta significativamente 48 ore dopo la co-coltura, quando gli assoni sono ben penetrati nel lato degli astrociti e interagiscono entrando in contatto diretto con gli astrociti qui.

Il trattamento con chinina sul lato neuronale del MCP assemblato ha indotto la morte cellulare neuronale. In modo interessante, ha inoltre stimolato il restringimento e la degenerazione dell'assone, nonché la riduzione della fluorescenza EGFP assonale. Questi cambiamenti dinamici dell'intensità della fluorescenza EGFP in risposta agli assoni hanno chiaramente dimostrato che l'attività del promotore Astroglia GT uno è modulata dall'interazione con l'assone.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire il sistema di coltura cellulare utilizzando la piattaforma di coltura microfluidica; una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita correttamente in pochi giorni.