Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare il saggio DTH trans vivo per monitorare sia le risposte specifiche per l'antigene pro-infiammatorie che anti-infiammatorie nei soggetti umani. In primo luogo, isolare le cellule mononucleate del sangue periferico dal sangue periferico del soggetto umano. Successivamente, mescolare la preparazione di PBMC con PBS.

Antigene di richiamo, antigene del test e antigene del test più antigene di richiamo. Procedere con le misurazioni preliminari delle zampe e iniettare le miscele preparate nei topi. Ripetere le misurazioni delle zampe dopo 24 ore. Tre.

Pattern definitivi di risposte DTH possono essere di tipo regolatorio, non regolatorio e sensibilizzato. Il saggio trans vivo di ipersensibilità ritardata può essere applicato per determinare parametri clinici come le risposte alloreattive, in cui la fonte dell'antigene è rappresentata dalle cellule del donatore del trapianto. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi in vitro esistenti consiste nella possibilità di rilevare facilmente, mediante un unico sistema sperimentale, sia le risposte pro-infiammatorie che quelle regolatorie verso antigeni alloreattivi, autoantigeni o antigeni tumorali.

Egon, un ricercatore del mio laboratorio, illustrerà ora la procedura utilizzando sangue periferico umano fresco raccolto in provette con citrato acido e destrosio per evitare l'attivazione delle piastrine. Isolare le PBMC mediante mezzo di separazione per linfociti seguendo i metodi standard. Lavare il preparato di PBMC con PBS per rimuovere le piastrine contaminanti.

Se è presente una contaminazione evidente da globuli rossi, eseguire la lisi delle cellule rosse utilizzando un buffer di lisi CK. Eseguire quindi altri due lavaggi con PBS Resus. Sospendere i PBMC in PBS a una concentrazione di 10 milioni di PBMC per millilitro per l'antigene allo.

Iniziare con le BMC provenienti dal sangue periferico del donatore, isolate utilizzando la procedura mostrata in precedenza. Successivamente, risospendere le cellule del donatore in PBS a una concentrazione di 120 milioni di cellule per millilitro e aggiungere un micromolare di PMSF per prevenire il degrado proteico.

Ora sottoporre la sospensione cellulare a sonificazione utilizzando sette impulsi di un secondo ciascuno con un sonicator a sonda da due millimetri. Utilizzando un emocitometro, verificare l'alterazione di oltre il 90% delle cellule.

Successivamente, centrifugare il campione a 14.000 g a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Trasferire con attenzione il soprannatante in due tubi con chiusura di sicurezza e determinare la concentrazione proteica mediante metodi standard per ogni iniezione. Aliquotare sette volte 10 alla sesta PBMC in due millilitri.

I tubi Safe Lock pelletizzano le cellule mediante centrifugazione. Preparare innanzitutto la sospensione del controllo negativo di PBMC in 35 microlitri di PBS. Successivamente, per il controllo positivo, aggiungere 25 microlitri di un antigene di richiamo, tetano, toxoid, difterite, toxoid, e regolare il volume di iniezione a 35 microlitri con PBS.

In base al disegno sperimentale per la valutazione della risposta specifica del donatore, risospendere il pellet cellulare in 10 microlitri di antigene del donatore più 25 microlitri di PBS per un volume totale di 35 microlitri. Per valutare la regolazione specifica dell'antigene del donatore sperimentalmente, risospendere il pellet cellulare in 35 microlitri aggiungendo 10 microlitri di antigene del donatore e 25 microlitri di antigene di richiamo TT DT. Dopo aver anestetizzato il topo con isoflurano, posizionare un calibro a molla al centro di un cuscinetto plantare con un bordo a contatto con l'ultima pianta del piede per fornire un punto di riferimento che mantenga costante il sito di misurazione quando la lettura del calibro si è stabilizzata.

Registrare lo spessore di base della pianta del piede per l'iniezione nella pianta del piede. Posizionare la siringa con l'ago rivolto verso le dita dei piedi e il becco verso l'alto. Procedere ora con le iniezioni sottocutanee di ciascuna sospensione cellulare nelle piante dei piedi posteriori del topo.

Primo, iniettare lentamente il cuscinetto plantare destro con il preparato di controllo negativo. Successivamente, iniettare il cuscinetto plantare sinistro con il controllo positivo di PBMC più TT dt. Ora restituire il topo alla sua gabbia.

Punto due, iniettare nel cuscinetto plantare destro PBMC insieme all'antigene allogenico e nel cuscinetto plantare sinistro PBMC insieme all'antigene allogenico più TT dt. Assicurarsi che non vi sia alcuna fuoriuscita entro 18-24 ore dall'iniezione. Anestetizzare ogni topo con isoflurano e ripetere la misurazione del gonfiore del cuscinetto plantare.

Sottrarre lo spessore di ciascun cuscinetto plantare prima dell'iniezione dal valore post-iniezione per ottenere il valore di gonfiore del cuscinetto plantare. Quindi calcolare il gonfiore netto specifico per l'antigene sottraendo il valore di gonfiore del cuscinetto plantare del controllo dai valori di gonfiore del cuscinetto plantare ottenuti dai trattamenti. Verificare la lettura del controllo positivo rispetto a una risposta del controllo positivo all'antigene di richiamo TT DT maggiore o uguale a 25 volte 10 alla meno quattro pollici in più.

È richiesta una risposta di base al PBS affinché il test sia considerato valido. Successivamente, determinare l'inibizione delle risposte di richiamo in presenza di antigeni del donatore. Questo esperimento valuta i soggetti trapiantati renali per la risposta specifica agli antigeni del donatore e per la regolazione.

Esistono tre principali schemi di ipersensibilità ritardata nei pazienti trapiantati: regolatorio, non regolatorio e sensibilizzato. Tutti i pazienti hanno risposto in modo intenso al controllo positivo dell'antigene di richiamo tt. Il paziente numero 62 mostra lo schema regolatorio, caratterizzato da una risposta debole all'antigene del donatore e da una marcata soppressione associata alla risposta all'antigene di richiamo in presenza dell'antigene del donatore.

Questo è il profilo che è stato associato alla tolleranza verso trapianti d'organo allogenici. Il paziente numero 48 mostra un profilo non regolatorio, caratterizzato da una risposta debole verso il donatore, ma senza soppressione correlata. Questo profilo è stato spesso osservato in pazienti in trattamento con farmaci immunosoppressori.

Il paziente numero otto presenta il profilo sensibilizzato verso il donatore, caratterizzato da una risposta elevata all'antigene del donatore e assenza di soppressione correlata. Questa risposta è associata al rigetto del trapianto. In studi clinici di caso, le BMC del donatore provenienti da soggetti arruolati in uno studio osservazionale sono state analizzate per valutare la via indiretta specifica per il donatore, nonché le risposte dei linfociti T effettori e dei linfociti T regolatori, al fine di determinare il ruolo della regolazione specifica per il donatore nella tolleranza clinica.

Le risposte indirette dei linfociti T agli antigeni del donatore rivelano uno spettro distinto tra i diversi gruppi arruolati. Il gonfiore della pianta del piede aumenta all'aggravarsi dello stato clinico del paziente, passando da condizioni di tolleranza a quelle di rigetto cronico. In questo caso, il saggio di soppressione associata misura la via indiretta anti-donatore della risposta dei linfociti T regolatori.

Questi dati mostrano una diminuzione delle risposte regolatorie nell'intervallo che va dai pazienti più tolleranti a quelli intermedî fino ai pazienti con rigetto cronico meno tolleranti. Nel complesso, la regolazione immunitaria misurata mediante il saggio DTH trans vivo sembra essere un meccanismo importante per l'accettazione dell'allograft renale.

Un ambito promettente è l'applicazione del saggio TDTH nel monitoraggio dell'autoimmunità. Il nostro studio sul ruolo del collagene di tipo cinque nel processo patologico della sindrome da bronchiolite OBL ha rivelato che il rischio relativo più elevato di sviluppo della BOS è stato osservato in pazienti con risposta positiva al collagene. Cinque pbmc da riceventi di trapianto polmonare, ma non da controlli sani o dal collagene.

Quattro pazienti con sindrome da buon pascolo reattivi dopo trapianto renale erano spesso reattivi al collagene V. Il saggio TDTH può essere utilizzato anche per verificare la reattività dei PBMC provenienti da pazienti oncologici nei confronti di antigeni specifici del tumore. Ad esempio, la presenza di cellule T regolatorie specifiche per PAP in pazienti con cancro alla prostata potrebbe limitare la risposta alla vaccinazione con l'antigene PAP.

Il saggio TRANSVAAL DTH è un test diagnostico innovativo con applicazioni cliniche nella valutazione delle risposte immunitarie mediate da cellule in pazienti sottoposti a trapianto, affetti da cancro o da malattie autoimmuni. È particolarmente utile perché non solo consente il monitoraggio delle risposte di richiamo dei linfociti T effettrici, ma può anche essere impiegato per rilevare le risposte dei linfociti T regolatori, in quanto non si basa sulla misurazione di una specifica citochina per identificare le cellule T effettrici o regolatorie. È molto flessibile e ampiamente applicabile.