Analisi trascrittomica di campioni chirurgici retiniche umane Utilizzo ufficiale
14 agosto 2013
Abbiamo utilizzato campioni di retina da retinectomy per un'analisi trascrittomica di distacco di retina. Abbiamo sviluppato una procedura che consente la conservazione di RNA tra i blocchi chirurgici e il laboratorio. Abbiamo standardizzato un protocollo per purificare l'RNA da cesio ultracentrifugazione cloruro di assicurare che gli RNA purificati sono adatti per l'analisi di microarray.
L'obiettivo generale di questa procedura è purificare l'RNA da campioni chirurgici retinici umani per l'analisi del trascrittoma nel distacco di retina. Utilizzando il diario per fare ciò, i reagenti e i materiali necessari per la raccolta del campione chirurgico vengono preparati in laboratorio e inviati all'ospedale. Durante la procedura chirurgica, il campione viene raccolto e restituito al laboratorio.
L'RNA viene quindi purificato utilizzando una procedura standardizzata di gradiente di cloruro di cesio e viene valutata la qualità dell'RNA purificato. In definitiva. L'analisi dell'espressione dell'mRNA mostra che sia l'infiammazione che la degenerazione dei fotorecettori sono coinvolte nel distacco della retina, indicato da cambiamenti nell'espressione di geni chiave. In questi processi identificati dall'analisi trascrittomica, il vantaggio principale del giornale rispetto alla purificazione dell'orna esistente come il clor GTIN dall'estrazione, noto anche come ole, è il risultato che l'orna non è contaminata dal DNA.
L'applicazione di questa tecnica si estende alle terapie del distacco di retina perché fornisce mezzi tecnici per sviluppare nuove terapie adiuvanti. Per ogni campione da raccogliere, utilizzare una pipetta priva di RNA per riempire una provetta a fondo tondo in polietilene sterile da cinque millilitri con 2,4 millilitri di una soluzione di cloruro di guina priva di sei RNA molari. Utilizzare gas argon per riempire la parte superiore dei tubi.
Quindi posizionare rapidamente il tappo premendo saldamente per assicurarsi che sia sigillato. Ciò impedirà l'ossidazione del cloruro di guinea per diversi anni di conservazione nell'armadio chirurgico. Quindi, posizionare ciascuna delle provette da cinque millilitri in una provetta sterile in polipropilene da 50 millilitri, a fondo conico.
Dopo aver aggiunto il fazzoletto e avvitato il tappo, posizionare le provette da 50 millilitri in una rastrelliera di polistirolo. Quindi posiziona lo scaffale e le buste preparate insieme ai moduli di spedizione preparati in una scatola di cartone in ospedale. Portare la scatola di cartone dall'armadio chirurgico alla sala operatoria.
Durante l'intervento chirurgico, posizionare il campione retinico in una provetta riempita con quantità e soluzione di cloruro. Chiudere bene il tubo. Mescolare brevemente il tubo.
Quindi posizionare il tubo sul bilanciere del tubo del sangue per 10 minuti. Compilare il modulo di accompagnamento con la data dell'intervento di identificazione del paziente ed eventuali osservazioni aggiuntive. Quindi scrivere il numero di identificazione sul tubo numerato da 50 millilitri corrispondente.
Quindi posizionare la provetta da cinque millilitri con il campione chirurgico nella provetta da 50 millilitri. Sostituire il fazzoletto di carta e tappare il tubo. Quindi posizionare la provetta da 50 millilitri e il modulo di assunzione del campione nell'apposita busta imbottita e sigillarla.
Una volta ricevuto il campione in laboratorio, omogeneizzare il campione nella sua provetta da cinque millilitri con un omogeneizzatore poly tron TM alla massima impostazione per un minuto, muovendo la provetta su e giù. Una volta omogeneizzato il campione, per estrarre i polisaccaridi, aggiungere 270 microlitri di acetato di potassio a due molari e posizionare la provetta su uno shaker in posizione orizzontale. Agitare energicamente per 10 minuti, quindi centrifugare per 10 minuti a 6, 500 G a 20 gradi Celsius.
Dopo la centrifuga, utilizzare una pipetta per aspirare con cura la frazione solubile senza disturbare il pellet. Trasferire il surnatante in una provetta sterile da 14 millilitri priva di RNA. Accanto al surnatante, aggiungere 5,3 millilitri di 1% e Laurel Sarcosine in 100, millimolare tri e 3,2 grammi di cloruro di cesio.
La sarcosina solubilizza la membrana e il cloruro di cesio viene utilizzato per generare un gradiente. Mescolare il tubo agitando per un minuto. Aggiungere 1,8 millilitri di cloruro di cesio EDTA a una provetta da centrifuga sterile in polimero da 11 millilitri.
Quindi, con una pipetta sterile da 10 millilitri, sovrapporre la soluzione di RNA sulla soluzione di cloruro di cesio EDTA lasciandola scorrere lungo la superficie interna del tubo. Mettere le provette in una centrifuga. Se necessario, utilizzare una seconda provetta contenente i tamponi senza retina come bilancia e centrifugare per 24 ore a 225.000 G a 20 gradi Celsius.
Il giorno dopo. Dopo la rotazione, si sarà formato uno strato lipidico nella parte superiore del tubo. Il DNA sarà al centro e l'RNA sarà pellettato sul fondo del tubo.
Utilizzare una pipetta per pasta sterile per rimuovere ed eliminare con cura lo strato lipidico superiore con una seconda pipetta per pasta sterile. Rimuovere gradualmente la soluzione fino a quando il DNA viscoso non viene aspirato. Scartare la soluzione e il DNA.
Quindi, utilizzando una terza pipetta sterile per pastori, rimuovere ed eliminare la soluzione rimanente. Facendo attenzione a non disturbare il pellet di RNA. Ora usando un bisturi sterilizzato a fiamma, tagliare il tubo come mostrato qui e scartare la parte superiore.
Posizionare la parte rimanente capovolta su una garza sterile. Capovolgere il tubo e utilizzare una pipetta per sciacquarlo delicatamente con 160 microlitri di cloruro di guine. Lasciare asciugare il pellet per 10 minuti.
Una volta che il pellet è asciutto, risospeso in 150 microlitri di tris, E-D-T-A-S-D-S. Successivamente, aggiungi 150 microlitri di tris, EDTA e 30 microlitri di acetato di sodio a tre molari, quindi agita per precipitare l'RNA. Aggiungere 900 microlitri di etanolo ghiacciato al 100%.
Agitare il tubo e posizionarlo sul ghiaccio fondente per 30 minuti. Quindi centrifugare la provetta per 30 minuti a 18.000 g a quattro gradi Celsius. Dopo il giro, un minuscolo pallino bianco può essere visibile o meno.
Indipendentemente dal fatto che il pellet sia visibile o meno, aspirare delicatamente il surnatante e scartarlo. Quindi, per rimuovere il sale in eccesso, aggiungere 500 microlitri di temperatura ambiente, etanolo al 70% e vortex, la centrifuga a tubo, il tubo per 20 minuti a 18.000 G a quattro gradi Celsius. Dopo aver ripetuto il lavaggio e la centrifuga con etanolo al 70%, utilizzare una pipetta P 200 per rimuovere l'etanolo residuo.
Lascia asciugare il pellet all'aria per 10 minuti. Risospendere il pellet in 50 microlitri di acqua trattata, mescolare energicamente agitando per due minuti. Quindi posizionare il campione in un bagno d'acqua a 45 gradi Celsius per 15 minuti.
Per risospendere completamente l'RNA. Infine determinare la concentrazione di RNA mediante assorbanza a 260 nanometri e analizzare l'RNA mediante elettroforesi su gel secondo il protocollo. Nel documento di accompagnamento, Per esaminare il trascrittoma del distacco di retina, la procedura journal è stata utilizzata per recuperare e analizzare l'RNA retinico di 18 pazienti con distacco di retina e 18 controlli di pari età preparati utilizzando retine post-mortem.
L'RNA è stato successivamente purificato e analizzato utilizzando l'elettroforesi su gel e la base rettino, come descritto in questo rapporto, qui sono riportati i grafici radar che rappresentano l'espressione del monocita chemiotattico M, CP uno, gene, CCL due. La parte destra della figura etichettata RD corrisponde all'RNA dei pazienti con distacco di retina, mentre la parte sinistra etichettata N è l'RNA dei controlli, come si può vedere qui. Il distacco della retina provoca la sovraregolazione del CCL 2 come indicato dagli alti valori di C nella maggior parte dei campioni RD a destra rispetto a quelli dei controlli a sinistra.
Questo aumento indica un'infiammazione nei pazienti con distacco di retina, come si può vedere qui. L'espressione del gene GNAT uno che trasduce il fotorecettore dei bastoncelli è diminuita al contrario del CCL due, i valori sono bassi per i campioni RD a destra, è stata osservata una diminuzione dell'espressione dell'opsina del cono a onde corte O PN uno SW e il gene omeogenico CRX suggerisce anche la degenerazione dei fotorecettori sia dei bastoncelli che dei coni nei pazienti con distacco di retina Attraverso questo metodo può fornire informazioni sui cambiamenti di espressione genica dopo il distacco della retina. Può essere applicato anche ad altre patologie retiniche in modelli animali come le degenerazioni retiniche ereditarie.
Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché richiede la conoscenza dell'acido nucleico. Cy.Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale come workover, che l'RNA dopo la certificazione è complicato.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulla purificazione dell'RNA da campioni chirurgici retinici umani al fine di analizzare il trascrittoma nei casi di distacco della retina. Viene utilizzata una procedura standardizzata con gradiente di cloruro di cesio per garantire la qualità dell'RNA per ulteriori analisi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia della retina
- Trascrittomica
Sfondo
- Il distacco della retina può portare a una significativa perdita della vista.
- Comprendere i cambiamenti nell'espressione genica è fondamentale per lo sviluppo di strategie terapeutiche.
- La qualità dell'RNA è essenziale per un'analisi trascrittomica accurata.
- I metodi esistenti di purificazione dell'RNA possono portare a contaminazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per la purificazione dell'RNA da campioni retinici.
- Analizzare l'espressione dell'mRNA in relazione al distacco della retina.
- Valutare il coinvolgimento dell'infiammazione e della degenerazione dei fotorecettori.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni retinici durante la retinectomia.
- Preparazione di reagenti e materiali per l'estrazione dell'RNA.
- Procedura standardizzata di gradiente al cloruro di cesio per la purificazione dell'RNA.
- Valutazione della qualità dell'RNA per l'analisi con microarray.
Risultati principali
- Identificazione di cambiamenti chiave nell'espressione genica associati al distacco della retina.
- Evidenza di infiammazione e degenerazione dei fotorecettori nell'analisi trascrittomica.
- Dimostrazione che il nuovo metodo previene la contaminazione da DNA.
- Qualità migliorata dell'RNA, adatta per l'analisi con microarray.
Conclusioni
- Il metodo di purificazione dell'RNA sviluppato è efficace per campioni retinici.
- L'analisi trascrittomica fornisce informazioni sui meccanismi del distacco della retina.
- Studi futuri potranno sfruttare questo metodo per ulteriori ricerche sulle malattie retiniche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
Il distacco della retina provoca contemporaneamente infiammazione e degenerazione dei fotorecettori, creando un ambiente patofisiologico complesso che complica lo sviluppo di terapie. Il metodo jouRNAl consente un'analisi trascrittomico ad alta fedeltà di campioni retinici umani scartati chirurgicamente, fornendo una fonte scalabile di tessuto clinicamente rilevante per la validazione di bersagli. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando le firme molecolari ai fenotipi clinici, orientando le decisioni di avanzamento o interruzione nei percorsi di sviluppo oftalmologico.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la rilevazione simultanea di vie infiammatorie e degenerative nel tessuto retinico umano.
- Valore operativo: Trasforma campioni chirurgici di scarto in sistemi biologici validati, riducendo la dipendenza dai modelli animali per la valutazione precoce dei bersagli.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio fornendo dati espressivi derivati da soggetti umani su CCL2, GNAT1, OPN1SW e CRX come biomarcatori della progressione della RD.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce RNA privo di DNA, adatto per microarray e RT-PCR, garantendo specificità del saggio nelle letture dell'espressione genica.
- Valore operativo: Il protocollo standardizzato di gradiente al cloruro di cesio assicura riproducibilità tra lotti e siti, consentendo campagne di screening scalabili.
- Prontezza per il saggio: La qualità dell'RNA purificato viene convalidata mediante elettroforesi su gel e misurazione dell'assorbanza, supportando una valutazione affidabile dei composti negli schermi fenotipici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta al lavoro preclinico utilizzando campioni retinici umani per convalidare i risultati ottenuti in modelli animali di degenerazione retinica ereditaria.
- Allineamento dei biomarcatori: Identifica l'upregolazione di CCL2 e la downregolazione dei geni dei fotorecettori come firme traslabili per il monitoraggio terapeutico.
- Progressione con valutazione del rischio: Fornisce informazioni meccanicistiche sulla progressione della RD, orientando la progettazione di studi clinici stratificati in base ai biomarcatori.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo jouRNAl si integra nel percorso della scoperta, dall'identificazione iniziale del target fino alla validazione preclinica, consentendo una riduzione del rischio basata su tessuti umani prima dell'ottimizzazione del capostazione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi di infiammazione e degenerazione mediante analisi trascrittomica di campioni retinici umani.
- Screening: Fornisce output di RNA standardizzati e quantitativi adatti per il profilo dell'espressione genica ad alto rendimento.
- Analisi: Genera letture misurabili (ad esempio, upregolazione di CCL2, downregolazione di GNAT1) che consentono il confronto tra diverse condizioni e la priorizzazione di bersagli.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati dei campioni umani alla continuità preclinica permettendo analisi comparative in sistemi rilevanti per la malattia.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per l'estrazione di RNA da tessuti chirurgici, applicabile a diverse patologie retiniche e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità meccanicistica mediante la trascrittomica diretta su tessuti umani.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso la purificazione con cloruro di cesio, minimizzando la variabilità tra lotti negli studi multicentrici.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo evidenze molecolari di origine umana, riducendo il rischio biologico in fase avanzata nei programmi di oftalmologia.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli corretta in base al rischio, sulla base di firme contemporanee di infiammazione e degenerazione ottenute da campioni derivati dai pazienti.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione degli acidi nucleici e nelle tecniche di ultracentrifugazione su gradiente.
- Presuppone l'accesso a cloruro di cesio, ultracentrifughe e infrastrutture di laboratorio prive di RNasi.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i team chirurgici, di anatomia patologica e di biologia molecolare per il tracciamento dei campioni.
- L'adattamento ad altri tipi di tessuto potrebbe richiedere un'ottimizzazione dei passaggi di omogeneizzazione e lisi.
- Limite pratico: il rendimento di RNA dipende dal trasferimento tempestivo del campione e dall'evitare l'esposizione alle RNasi durante il prelievo chirurgico.
