Isolamento, elaborazione ed analisi dei murini gengivali

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed elaborare con precisione la mirin gengiva per ulteriori analisi di citometria a flusso. Ciò si ottiene isolando prima chirurgicamente la gengiva in modo meticoloso. Successivamente, il tessuto asportato viene processato per generare una sospensione a singola cellula.

Quindi viene eseguita la colorazione extracellulare e intracellulare con anticorpi. Infine, il campione viene analizzato mediante citometria a flusso. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano diverse popolazioni cellulari nella gengiva e cambiamenti cellulari che si verificano nel tessuto in seguito all'esposizione a un insulto immunologico mediante analisi di citometria a flusso.

Il vantaggio principale di questa tecnica, come nella chimica OC o nella mono fluorescenza, è che si tratta di un metodo rapido e semplice per analizzare un gran numero di cellule, consentendo l'analisi simultanea di diverse variabili, nonché l'ordinamento di vari tipi di cellule per ulteriori sperimentazioni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia, come ad esempio come i microrganismi influenzano l'omeostasi gengivale e come si relaziona con la perdita ossea indotta dall'infiammazione in un modello sperimentale di parodontite. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo iniziato ad affrontare il ruolo delle cellule RI durante la parodontite. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la tecnica di accelerazione GVA genica è difficile da imparare a causa delle dimensioni ridotte e dell'accesso relativamente scomodo al MU one J gva.

Per iniziare, preparare le soluzioni dei terreni e gli strumenti chirurgici sterilizzati secondo il protocollo di testo. Dopo l'eutanasia di un topo, secondo i metodi approvati dal comitato per la cura e l'uso degli animali della tua istituzione, usa forbici dritte affilate e smussate per tagliare entrambi i lati della cavità orale, comprese le guance e il ramo della mandibola, e tira verso il basso la mandibola dirigendo le forbici standard perpendicolarmente al piano dell'osso palaziale. Taglia i tessuti molli e duri in una linea immaginaria, un millimetro dietro i terzi molari.

Quindi, praticare un'incisione all'interno dei tessuti molli e duri, due millimetri dietro gli incisivi. Quindi tirare verso il basso la parte anteriore della bocca per esporre la cavità nasale con le forbici parallele al palato. Posizionare un'emorragia nella cavità nasale e utilizzare l'altra per praticare un'incisione nel vestibolo che taglia l'incisione posteriore.

Ripeti l'incisione sull'altro lato della mascella per staccarla dal cranio. Quindi taglialo al centro e taglia il tessuto palatale da ciascun emimascellare per raggiungere l'osso alveolare usando addominali e pinze. Staccare i tessuti gengivali dal bordo anteriore e metterli in una piastra con PBS e siero fetale di vitello al 2% o FCS per elaborare la gengiva, trasferirlo in una piastra di coltura con un millilitro di PBS, due milligrammi per millilitro di collagenasi di tipo due e un milligrammo per millilitro di DNA.

Tipo uno con lama chirurgica sterile numero 15. Tritare bene il tessuto prima di trasferirlo in una provetta conica da 15 millilitri. Lavare le cellule del tessuto rimanenti dalla piastra con un millilitro di P-B-S-F-C-S e trasferirle nella provetta.

Incubare il tessuto in un'incubatrice vibrante preriscaldata a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 20 minuti. Quindi aggiungere 20 microlitri di EDTA 0,5 molare e incubare per altri 10 minuti. Quindi, aggiungere P-B-S-F-C-S fino a 12 millilitri e centrifugare il campione a quattro gradi Celsius, 400 volte G per otto minuti.

Dopo aver rimosso il surnatante resus, sospendere le cellule due millilitri di P-B-S-F-C-S. Filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 70 micron dopo aver fatto girare il flusso a quattro gradi Celsius e 320 volte G per cinque minuti. Resus sospendere le cellule in 300 microlitri di P-B-S-F-C-S.

Infine, contare le cellule che lavorano sotto una cappa a temperatura fredda e le luci spente in un volume totale di 100 microlitri, aggiungere da 0,2 a 0,5 microgrammi di ciascun anticorpo selezionato per una volta 10 alla sesta cellula e agitare brevemente. Dopo aver incubato i campioni a quattro gradi Celsius per 15 minuti al buio, aggiungere due millilitri di P-B-S-F-C-S e centrifugare a 320 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Per fissare le cellule, aspirare il surnatante e poi, durante il vortice di resus, sospenderle aggiungendo goccia a goccia 500 microlitri di permanenti fredde BD cyto permanent.

Gli effetti cyto: incubare le provette a quattro gradi Celsius al buio per 40 minuti dopo il vortice di incubazione. Brevemente quindi aggiungere un millilitro di BD permanente lavare, tamponare e centrifugare a 800 volte G a quattro gradi Celsius per sette minuti. Dopo aver ripetuto il lavaggio, aspirare tutto tranne 300 microlitri del tampone di lavaggio.

Quindi, per colorare le cellule a livello intracellulare in un volume totale di 100 microlitri, aggiungere un microgrammo ciascuno di anticorpi selezionati per uno volte 10 alle sei cellule. Agitare brevemente e incubare al buio per 30 minuti. Dopo aver lavato le cellule due volte come prima e rimosso tutti i supernat, risospendere le cellule in 300 microlitri di tampone di lavaggio per permanente BD freddo fresco.

Dopo un breve vortice, filtrare la sospensione in tubi fax. Conservare i tubi sul ghiaccio o in frigorifero al buio fino al momento di eseguire l'analisi fax. Cellule gengivali raggruppate da due topi naïve.

Sono stati eseguiti in un citometro a due flussi LSR e analizzati utilizzando il software FlowJo. I grafici di dispersione laterale e di dispersione diretta mostrati qui dimostrano la distribuzione delle celle. La strategia di gating per identificare linfociti, monociti, cellule dendritiche e granulociti è indicata a scopo di confronto.

Questa figura rappresenta un grafico fax che illustra le cellule gengivali purificate da topi infetti da P gingivalis 21 giorni dopo la sonda orale nel contesto della parodontite sperimentale. Un aumento delle varie popolazioni di cellule immunitarie può essere facilmente rilevato nei topi infetti rispetto ai topi naïve mostrati qui. Le cellule immunitarie nella gengiva processata vengono identificate mediante gating sulle cellule che esprimono il marcatore ematopoietico CD 45.

Queste cellule sono state ulteriormente segregate in tre cellule T positive CD mostrate in questa figura. I neutrofili sono stati identificati anche in base all'espressione delle molecole LY sei G e CD 11 B. Infine, le cellule della mano di Langer e il sottogruppo epiteliale di cellule dendritiche sono stati identificati mediante gating su MHC classe due positive CD 11 C positive ed espressione di EPAM e RIN CD 2 0 7 Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore e mezza o cinque ore se eseguita correttamente Seguendo questa procedura.

Altri metodi come la PCR in tempo reale possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come l'espressione genica di una singola cellula dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la risposta locale nel GVA contro qualsiasi insulto nel campo della ricerca parodontale. Questa tecnica ci ha permesso di chiarire il ruolo delle cellule immunitarie e non immunitarie del GVA G nella patogenesi della parodontite sperimentale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare ed elaborare il GVA urinario al fine di ottenere una sospensione a singola cellula, che sarà ulteriormente sottoposta a una colorazione vir extra e intracellulare per l'analisi della citometria a flusso.