La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l'esempio di bovini cellule endoteliali corneali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare la comunicazione intercellulare attraverso i canali di giunzione gap e i canali HEMI mediante quantificazione della diffusione dell'onda di calcio intercellulare evocata dalla stimolazione meccanica in monostrati di cellule endoteliali corneali primarie. Ciò si ottiene isolando prima le cellule endoteliali corneali primarie da occhi bovini freschi. Come seconda fase, due o tre giorni dopo la semina in vetrini a camera, il monostrato confluente di cellule viene caricato con il colorante fluorescente sensibile al calcio O O 4:00 AM. Successivamente, applichiamo uno stimolo meccanico controllato e localizzato a una singola cellula del monostrato per evocare un'onda di calcio intercellulare, che viene visualizzata al microscopio confocale.

I risultati mostrano la diffusione della propagazione intercellulare dell'onda di calcio. In definitiva, l'inibizione dei canali di giunzione gap e dei canali HEMI viene utilizzata per svelare le proprietà e la regolazione di diversi Conex e panex e isoforme che formano canali di giunzione gap e canali HEMI. Il vantaggio principale della propagazione dell'onda di calcio intercellulare indotta dalla stimolazione meccanica è che fornisce un metodo semplice e affidabile per esaminare il contributo e le proprietà dei canali di connessione e di eliminazione in modo non invasivo.

Inoltre, il metodo si basa sulle molecole di segnalazione fisiologiche e sulle cascate presenti nei sistemi cellulari studiati. Infine, è facilmente adattabile a una varietà di sistemi cellulari, comprese le cellule primarie e i modelli cellulari che esprimono ectopicamente determinate connessioni o isoforme di PanIN. Questi metodi possono fornire informazioni sulla funzione e la regolazione dinamica della connessione e dei canali di giunzione del cappuccio basati su PanIN e dei canali HEMI mediante l'uso di knockdown mediato dall'RNA SI di connessioni endogene o panic nelle isoforme e dall'uso di inibitori selettivi dei canali di giunzione del cappuccio e dei canali HEMI.

Questo sistema non è sicuramente limitato a entrambe le cellule endoteliali corneali. È adattabile praticamente a qualsiasi tipo di cellula e anche ai tessuti più complessi. Questa procedura utilizza un occhio appena incapsulato di una mucca di età non superiore a 18 mesi e non più di cinque minuti dopo l'autopsia.

Questo è stato trasportato in laboratorio nella soluzione salina dell'equilibrio di Earl e nella soluzione di iodio all'1% a quattro gradi Celsius. Per prima cosa, trasferisci l'occhio in una piastra di Petri da 100 millimetri per 20 millimetri. Successivamente, sciacquare l'occhio con EBSS contenente l'1% di iodio.

Quindi sterilizzarlo con una soluzione contenente il 70% di etanolo da questo punto in poi. Lavorare in una cappa sterile. Sezionare con cura la cornea dall'occhio e posizionarla in una piastra di Petri da 35 millimetri per 10 millimetri contenente EBSS con lo strato di cellule epiteliali rivolto verso l'alto.

Rimuovere con cura il tessuto dell'iride rimanente ancora attaccato alla cornea. Se necessario, trasferire la cornea in un altro piatto di EBSS con lo strato di cellule endoteliali rivolto verso l'alto e quindi risciacquare due volte con EBSS. Quindi, posizionare la cornea con lo strato endoteliale rivolto verso l'alto in una clessidra e coprire con il terreno di crescita.

Per risciacquare, rimuovere il fluido con una pipetta di aspirazione. Applicare 300 microlitri di soluzione di tripsina da 0,5 grammi per litro sullo strato endoteliale della cornea. Mettere la clessidra contenente la cornea in una capsula di Petri coperta e trasferirla nell'incubatrice per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo aver recuperato la clessidra, raschiare delicatamente le cellule endoteliali dalla cornea con una pipetta da pascolo in vetro a forma di uncino lucidato a fuoco. Aspirare la soluzione contenente le cellule endoteliali e aggiungerla a un pallone di coltura quadrato di 25 centimetri contenente quattro millilitri di terreno di coltura. Successivamente, applicare 300 microlitri di terreno di coltura sulla cornea.

Ripetere la raschiatura e aggiungere la soluzione contenente le cellule endoteliali al pallone di coltura. Ripetere ancora una volta questo passaggio, quindi posizionare i palloni di coltura contenenti le cellule endoteliali corneali nel terreno di crescita nell'incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Due giorni dopo, aggiungere sei millilitri di terreno di coltura e rinfrescare il terreno di coltura ogni due giorni.

Le cellule devono essere confluenti entro sette-10 giorni dall'isolamento al passaggio. Per prima cosa, aspirare il terreno di coltura e poi risciacquare due volte con EBSS. Quindi aggiungere due millilitri di giri in soluzione alle cellule e posizionare il pallone nell'incubatrice per tre o quattro minuti.

Quindi aggiungere 12 millilitri di terreno di coltura e pipettare il terreno tre volte dentro e fuori per disperdere le cellule. Quindi contare le cellule utilizzando un emo, un citometro o un contatore automatico di cellule. Aggiungere 165.000 cellule a due vetrini di coltura a pozzetti.

Successivamente, preparare fiasche di coltura quadrate da 75 centimetri per un nuovo passaggio a una densità di 6.250 cellule per centimetro quadrato e aggiungere terreno di coltura fresco fino a un volume totale di 25 millilitri e posizionare le fiasche e i vetrini della camera nell'incubatore. Il terreno viene rinfrescato ogni due giorni e la cofluenza dello strato cellulare dovrebbe essere raggiunta entro tre o quattro giorni. Per prima cosa, caricare le cellule nel vetrino della camera con 10 micromolari di influenza oh 4:00 AM in soluzione salina tamponata con fosfato per 30 minuti a 37 gradi Celsius con un leggero agitamento mentre le cellule sono in incubazione nell'influenza oh 4:00 AM accoppiare una micro pipetta di vetro con un diametro della punta inferiore a un micrometro a un nano posizionatore di piso electro crystals, e collegarsi ad un amplificatore montato su un micro manipolatore.

Impostare la tensione del nano posizionatore tra 0,2 e 1,5 volt. Rimuovere l'influenza della soluzione delle 4:00 del mattino. Quindi lavare le cellule cinque volte con soluzione salina tamponata con fosfato, quindi incubare le cellule con PBS per almeno cinque minuti a temperatura ambiente prima della misurazione.

Eccitato 488 nanometri con laser argonne e utilizzare il divisore di fascio HFT 48. Raccogliere l'emissione fluorescente a 530 nanometri utilizzando un filtro di emissione a passaggio lungo, LP 5 0 5 con il foro stenopeico impostato al minimo qui viene utilizzato un obiettivo ad immersione in olio 40 x. Posiziona il vetrino da camera sul tavolino di un microscopio confocale e trova un'area di celle di confluenza.

Quindi, spostare il micromanipolatore per posizionare la micropipetta di vetro in modo che tocchi la membrana cellulare con un angolo di 45 gradi. Azionare il micromanipolatore per toccare brevemente meno dell'1% della membrana a singola cellula con la micropipetta di vetro e provocare una stimolazione meccanica di un secondo alla cellula. Quindi misurare le variazioni spaziali della concentrazione di ioni calcio in seguito alla stimolazione meccanica con un microscopio confocale, raccogliere e memorizzare le immagini.

Infine, disegnare una regione poligonale di interesse per definire l'area superficiale totale delle cellule reattive utilizzando il software del microscopio confocale. I transienti di calcio indotti dalla stimolazione meccanica sono mostrati in diversi punti temporali in condizioni di controllo nelle cellule endoteliali corneali bovine mediante immagini di fluorescenza pseudo colorate rappresentative, le intensità di fluorescenza prima della stimolazione sono mostrate nella prima immagine. La freccia bianca nella seconda immagine identifica la cellula stimolata meccanicamente.

L'onda di calcio si propaga a sei strati cellulari vicini con un'area totale di cellule raggiunta dall'onda che dà un'area attiva di 62.870 micrometri quadrati. Il grafico a linee mostra l'andamento temporale del valore di fluorescenza normalizzato o NF nella cella stimolata meccanicamente etichettata ms e il valore medio di NF negli strati cellulari adiacenti da uno a cinque etichettati sul grafico come MB uno a MB cinque. Queste immagini mostrano cambiamenti significativi nella diffusione delle onde di calcio intercellulari dopo il trattamento con nucleotidi esogeni nel grafico a sinistra e dopo il trattamento con inibitori dell'aasi ectonucleotidica nel grafico a destra in modo più dettagliato, il grafico a sinistra mostra una significativa diminuzione dell'area attiva dopo il trattamento delle cellule endoteliali corneali bovine con le esogene Aras Aase sei e Aase sette, che idrolizza A TP e A DP inibendo così la via di comunicazione intercellulare pericrina.

L'asterisco indica un valore P inferiore a 0,001 in presenza rispetto all'assenza di asso. Il grafico a destra mostra un aumento significativo dell'area attiva dopo il trattamento di BCEC con un inibitore selettivo dell'ectonucleotide, A RL 6 7 1 56, migliorando così la via di comunicazione intercellulare pericrina. L'asterisco indica un valore P inferiore a 0,001 in presenza rispetto all'assenza di un RL una volta padroneggiato.

Questa tecnica può essere eseguita in 5-10 minuti per un esperimento in una condizione, se eseguita correttamente. L'esecuzione di tutta una serie di esperimenti da cui è possibile confrontare diverse condizioni richiede un giorno per trarre conclusioni statistiche. Devono essere utilizzati esperimenti indipendenti eseguiti in giorni diversi e da diversi lotti di cellule isolate.

La misurazione e la quantificazione della propagazione intracellulare delle onde di calcio consente l'identificazione e la caratterizzazione della regolazione biologica cellulare di diverse isoforme di connessione e ine come i canali di giunzione gab e i canali HEMI. Vorrei anche sottolineare che questo metodo non sta in piedi da solo, ma dovrebbe essere completato da altri approcci molecolari e funzionali che vanno dal trasferimento della dieta al rilascio di TP e all'elettrofisiologia.