Protocolli ottimizzati per Mycobacterium leprae Strain Management: congelata Stock Conservazione e Manutenzione in topi nudi atimici
23 marzo 2014
Mycobacterium leprae, l'agente eziologico della lebbra, non cresce in vitro. Descriviamo un facile seguire protocollo per preparare una sospensione bacillare per assicurare il mantenimento di grandi quantità di M. leprae per una varietà di applicazioni. Protocolli per la propagazione tramite mouse zampa inoculazione, la valutazione della vitalità, il congelamento e lo scongelamento magazzino bacillare sono descritte in dettaglio.
Lo scopo di questo lavoro è mostrare come preparare una sospensione lipidica di mycobacterium altamente vitale. Per in topi nudi. Manterremo la vita dei bassi di un topo infetto, preferibilmente durante la fase iniziale dell'infezione.
Per garantire rese altamente vitali, sopprimere l'animale all'interno della cabina di sicurezza biologica. Trattenere l'impulso posteriore con una pinza emostatica. Tagliarli con le convulsioni e immergerli in iodio al 2% per 20 minuti Per la decontaminazione, mantenere la posizione del punto con il poggiapiedi rivolto verso l'alto.
Raccogliere i tessuti molli Utilizzando una lama di bisturi, rimuovere le ossa della prima e della quinta falange per facilitare l'omogeneizzazione del tessuto. Metti il fazzoletto in una capsula di Petri sterile. Raschiare l'epidermide.
Tagliare il tessuto granulomatoso in piccoli pezzi con le forbici e attendere il successivo calcolo del programma di resa del tessuto. Trasferire i piccoli pezzi in un tubo contenente un ml di soluzione salina bilanciata di Hank. Aggiungere un ulteriore ml di matassa e omogeneizzare il fazzoletto tre volte per 15 secondi ogni volta a velocità. Quattro.
Inserire un colino cellulare in una provetta conica sterile da 50 ml. Pipettare la sospensione sul filtro e lasciare che la soluzione passi per gravità. Per eliminare i detriti, aggiungere altri due MLS di matasse alla sospensione e omogeneizzarla nuovamente.
Utilizzando lo stesso ciclo, far passare la sospensione attraverso questo filtro. Suona il colino aggiungendo le matasse. Per portare il volume totale della sospensione a nove ml, aggiungere un ml di soluzione di tripsina allo 0,5% alla sospensione per raggiungere una concentrazione finale dello 0,05%.
Mescolare capovolgendo delicatamente la provetta incubata a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Dopo l'incubazione, portare il volume della sospensione a quattro MLS aggiungendo una centrifuga salina sterile a 1700 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius, scartare il supernat e risospendere il pallet picchiettando la provetta. Aggiungere un ml di soluzione fisiologica e mescolare.
Trasferire la sospensione in un nuovo tubo. Omogeneizzare la sospensione vascolare utilizzando una siringa da insulina da un ml con un ago calibro 26 mentre si trasferisce la sospensione in un nuovo tubo. Eseguire il controllo microbiologico della sospensione posizionando due gocce di 18 medium, sette H nine per infusione di cuore cerebrale.
11 Stein Genesen incubato a 37 gradi Celsius. E poi seguire le procedure di controllo microbiologico di routine. Per la colorazione del codice Z.
Prepara un uno a 10 e uno a cento. Diluizione della sospensione S in soluzione salina. Omogeneizzare ogni diluizione prima di preparare queste luci per il conteggio, preparare tre vetrini disegnando tre cerchi di diametro interno di 10 millimetri sulla superficie di ciascun vetrino utilizzando un pennarello a inchiostro indelebile.
Ora circonda i cerchi con la penna immunoistochimica. Etichettare queste luci usando una matita numero due per preparare le luci per le tre concentrazioni. Non diluito da uno a 10 e da uno a cento.
Pipettare cinque microlitri della soluzione di siero fenolico e 10 microlitri della sospensione di sary in ciascun cerchio, omogeneizzare e distribuire uniformemente la sospensione su tutta l'area del cerchio. Utilizzando il manico di un anello usa e getta, posiziona queste luci su un tavolo piano ad asciugare dopo l'asciugatura. Risolvili passando queste luci tre volte sulla fiamma blu con le sospensioni da scapolo rivolte verso l'alto.
Eseguire un codice Zuni di sostegno. Esamina queste diapositive. Le tre diluizioni.
Scegliere la diluizione più appropriata per il conteggio del sario. Preparare 200 microlitri di sospensione di sary uccisa in autoclave la sospensione vascolare per 30 minuti a 121 gradi Celsius. Utilizzare il kit di vitalità batterica L 7 0 0 7 live dead back light per la colorazione fluorescente di lipidi microbatterici.
Preparare una diluizione da 10 della soluzione A e da una a 20 diluizioni della soluzione B.Subito prima dell'uso. A ogni 200 microlitri di sospensione vascolare non diluita originale e uccisa, aggiungere 3,6 microlitri della soluzione diluita A e sei microlitri della soluzione diluita B.Dopo 15 minuti di incubazione al buio, calmare la sospensione a 10.600 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il super natin con la pipetta reus.
Sospendi il pellet in 50 microlitri di glicerolo al 10%, omogeneizzalo pipettandolo su e giù. Posizionare otto microlitri di ciascuna sospensione su un vetrino e coprire con un piccolo vetrino. Proteggendolo dalla luce.
Osservare le sospensioni al microscopio a fluorescenza. Preparare la sospensione con la concentrazione di 10-7 BA lip per ml, qu un ml di mezzo di congelamento in ogni fiala criogenica. Quindi aggiungere 150 microlitri della sospensione S a un ml di terreno di congelamento e omogeneizzarlo capovolgendo il tubo.
Posizionare la fiala criogenica all'interno del contenitore di congelamento. Mantenere il contenitore a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Trasferisci i tubi in una scatola di conservazione e mantienili a meno 80 gradi Celsius per lo scongelamento.
Scongelare la sospensione congelata in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius. Trasferire la sospensione in un tubo conico contenente 20 miglia di soluzione fisiologica sterile. Si è rifiutato di concentrarsi.
La balina, ha seguito il protocollo di sostegno Z per il conteggio e il protocollo di colorazione fluorescente per la determinazione della variabilità. Preparare la sospensione contenere da 10 a 8 BA per pasto, omogeneizzare la sospensione prima di inoculare ogni animale. Tirare un centinaio di microlitri in una siringa da insulina e inoculare 30 microlitri nei cuscinetti posteriori delle zampe di ogni animale per determinare la vitalità.
La fluorescenza verde si osserva in tutti i BAI e la fluorescenza rossa solo in quel bai. Quando i BAI sono a controllo inossidabile, si osserva la stessa intensità della luce BAI verde e rossa. L'inoculazione di M Lepar congelato per periodi diversi produce da 10 a 1000 volte il numero di BAI recuperati dopo sette mesi.
Come osservazione finale, vorremmo aggiungere che, poiché l'IL leid non cresce in vitro, questo protocollo consente un modo rapido e semplice per mantenere l'yl Leid vitale disponibile per ulteriori usi in laboratorio.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la preparazione di una sospensione altamente vitale di Mycobacterium leprae, l'agente causativo della lebbra, che non può essere coltivato in vitro. Il metodo comprende passaggi per l'inoculazione, la valutazione della vitalità e la conservazione della scorta batterica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Malattie infettive
- Tecniche di laboratorio
Sfondo
- Mycobacterium leprae è responsabile della lebbra.
- L'organismo non può essere coltivato in condizioni di laboratorio.
- Il mantenimento di ceppi vitali è fondamentale per la ricerca.
- I protocolli per la manipolazione e la conservazione di M. leprae sono limitati.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo affidabile per la preparazione di sospensioni di M. leprae.
- Garantire la vitalità dei bacilli per diverse applicazioni.
- Descrivere in dettaglio le procedure di inoculazione e conservazione.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una sospensione bacillare da tessuto di topo infetto.
- Omogeneizzazione e filtrazione del tessuto.
- Controllo microbiologico e valutazione della vitalità.
- Protocolli di congelamento e scongelamento per la conservazione a lungo termine.
Risultati principali
- Preparazione riuscita di una sospensione vitale di M. leprae.
- Metodi dimostrati per l'inoculazione dei topi con la sospensione.
- La vitalità dei bacilli è stata confermata mediante tecniche di colorazione.
- L'inoculazione ha prodotto aumenti significativi nel recupero dei bacilli.
Conclusioni
- Questo protocollo fornisce un modo rapido ed efficiente per mantenere M. leprae.
- Permette ulteriori ricerche e applicazioni in laboratorio.
- Studi futuri potranno basarsi su questo metodo per diverse esigenze sperimentali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Per la ricerca sulle malattie infettive in cui i patogeni non dispongono di sistemi di coltura in vitro, mantenere scorte di patogeni vitali è essenziale per la validazione degli obiettivi e lo sviluppo di saggi. Questo protocollo consente la preparazione riproducibile di sospensioni di Mycobacterium leprae da topi nudi atimici, garantendo rese bacillari costanti per applicazioni successive. L'approccio colma una lacuna critica nell'infrastruttura della ricerca sulla lebbra fornendo un metodo standardizzato per la conservazione dei ceppi e la valutazione della vitalità.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della viabilità e della patogenicità di M. leprae in un modello ospite fisiologicamente rilevante.
- Valore operativo: Fornisce una fonte rinnovabile di bacilli per studi di interazione con bersagli costanti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera sospensioni bacillari standardizzate con vitalità quantificata per saggi di screening antimicrobico.
- Valore operativo: Favorisce la riproducibilità del saggio attraverso un'input batterica controllata e la normalizzazione della vitalità.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Facilita studi di dose-risposta in modelli murini utilizzando ceppi batterici conservati con nota viabilità.
- Valore operativo: Consente studi preclinici longitudinali mediante la conservazione a lungo termine dei ceppi a -80°C.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui la vitalità dell'agente patogeno incide direttamente sulla fiducia nel bersaglio e sull'affidabilità dell'identificazione dei composti promettenti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi fornendo M. leprae quantificabili e vitali per modelli di infezione.
- Screening: Consente la preparazione standardizzata dell'inoculo per test di suscettibilità ai composti.
- Analisi: Include la valutazione della vitalità mediante colorazione fluorescente e il conteggio dei bacilli per la normalizzazione dei dati.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati dello screening in vitro alla validazione in vivo attraverso la preparazione costante della sfida bacillare.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un archivio riutilizzabile di ceppi di M. leprae caratterizzati in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi attraverso input di patogeni controllati per vitalità.
- Valore operativo: La preparazione e conservazione standardizzate delle scorte riducono la variabilità tra esperimenti.
- Valore strategico: Riduce i rischi nella selezione degli obiettivi assicurando la rilevanza biologica del modello di patogeno.
- Impatto sul portafoglio: Permette decisioni di proseguimento o interruzione basate su un'efficacia antimicrobica riproducibile nei confronti di ceppi bacillari validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione asettica dei tessuti e nel contenimento dei patogeni (pratiche BSL-2/3).
- Presuppone l'accesso a colonie di topi nudi atimici e a microscopia fluorescente per la valutazione della vitalità.
- Necessita della standardizzazione dei passaggi di trattamento con tripsina e filtrazione per una rimozione costante dei detriti.
- Richiede la validazione dei cicli di congelamento/scongelamento per mantenere la vitalità bacillare durante i periodi di conservazione.
- È limitato dall'assenza di colture in vitro, richiedendo la propagazione in animali per il rinnovo delle scorte.
