Isolamento e Caratterizzazione chimica del lipide A da batteri Gram-negativi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare il lipopolisaccaride dalla superficie esterna di batteri gram-negativi e caratterizzare strutturalmente una porzione lipidica con l'uso di protocolli MS tandem. Ciò si ottiene mediante estrazione chimica del lipopolisaccaride dalla superficie cellulare batterica e successiva idrolisi acida lieve per liberare il lipide A dalla porzione polisaccaridica del lipopolisaccaride e successiva idrolisi acida lieve per liberare il lipide A dalla porzione polisaccaridica del lipopolisaccaride. Come seconda fase, una soluzione di lipidi A viene analizzata mediante MSMS a ionizzazione a spruzzo elettrostatico.

Nella nostra procedura, il lipide A viene analizzato mediante dissociazione indotta da collisione o MS MS basata sulla fotodissociazione ultravioletta per la caratterizzazione strutturale. I risultati mostrano differenze nel modello di frammentazione negli spettri di massa prodotti da protocolli MS indotti da collisione o da fotodissociazione ultravioletta basati su MS MS, dove UVPD produce un modello di frammentazione più informativo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che la spettrometria di massa tandem consente di chiarire gli analiti target in base all'interpretazione dei modelli diagnostici di frammentazione.

Le foto ultraviolette, in particolare la dissociazione, sono un metodo MSMS ad alta energia che produce frammenti ionici più diversificati rispetto alle tecniche esistenti come la dissociazione indotta da collisione. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto il metodo di spettrometria di massa UVPD utilizzato non è ancora commercializzato. Un'aggiunta, il metodo utilizza un laser che è stato integrato con uno spettrometro di massa tramite modifica personalizzata Prima di iniziare questa procedura.

Raccogliere le cellule da una coltura batterica da 250 mil, centrifugare le cellule a 10.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi versare il surnatante del media, lavare il pellet della cella con 50 mil di un XPBS. Dopo la centrifugazione per ripetere il pellet, le cellule fuoriescono il surnatante.

Successivamente, sospendere le cellule in 40 mil di un XPBS e dividerle in 2 provette da centrifuga in teflon da 250 mil. Aggiungere 25 mil di cloroformio e 50 M di metanolo a ciascun tubo per una miscela monofase bly dire. Mescolare per inversione e incubare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti.

Per garantire la completa lisi cellulare, centrifugare la miscela a 2000 volte G per 20 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Lavare il pellet LPS con circa 100 mil di una miscela monofase di Bly dire. Centrifugare a 2000 volte G per 20 minuti ed eliminare il surnatante.

Aggiungere 27 mil di tampone di idrolisi acida delicata al pellet LPS e mescolare pipettando su e giù fino a quando rimangono sonicate solo piccole particelle con una punta della sonda per sonicare in modo omogeneo Resus. Sospendere il pellet LPS in soluzione a un ciclo di lavoro costante per 20 secondi al 50% di potenza. Ripetere la sonicazione del campione due volte con 20 secondi per raffica e circa cinque secondi tra una raffica e l'altra.

Quindi far bollire i campioni a bagnomaria per 30 minuti. Togliere le provette dal bagnomaria e lasciare raffreddare il campione a temperatura ambiente. Prima di procedere all'estrazione del lipide A dopo l'idrolisi, convertire la soluzione SDS in una miscela BLY direzionale a due fasi aggiungendo 30 mil di cloroformio e 30 mil di metanolo per una miscela tampone di idrolisi acida lieve metoformio miscelata per inversione e centrifuga.

Il campione S per 10 minuti a 2000 volte G.Utilizzando una pipetta di vetro, estrarre la fase inferiore in una provetta da centrifuga in teflon pulita. Successivamente, eseguire una seconda estrazione aggiungendo 30 mil della fase inferiore da una miscela bly dire bifase pre-bilanciata alla fase superiore nella provetta del campione miscelata per inversione e centrifugare 2000 volte G per 10 minuti. Estrarre la fase inferiore con una pipetta di vetro e accumulare con la fase inferiore estratta. Precedentemente.

Lavare le fasi inferiori raggruppate aggiungendo 114 mil di fase superiore pre-equilibrata per creare una miscela a due fasi miscelata mediante inversione e centrifuga. Jet 2000 volte G per 10 minuti con un trasferimento in vetro. Pipetta. Trasferire la fase inferiore in un pallone di evaporatore rotante in vetro pulito e asciugare il campione utilizzando l'evaporazione rotante.

Quindi, aggiungere cinque mil di una miscela di cloroformio metanolo al pallone rotante e bagnare sonicare per almeno 30 secondi. Per facilitare la sospensione del lipide A dai lati del pallone. Utilizzare una pipetta di trasferimento in vetro per trasferire il lipide in una provetta di vetro pulita tappata con tappo a vite fenolico rivestito in A-P-T-F-E.

Asciugare il campione sotto un getto di azoto utilizzando un essiccatore ad azoto. Risospendere il lipide essiccato in un mil di una miscela di cloroformio metanolo. Dopo l'aggiunta del solvente, agitare la miscela per garantire la completa sospensione del resus.

Trasferire in una piccola fiala di vetro e asciugare con un essiccatore ad azoto. Conservare il campione essiccato a meno 20 gradi Celsius fino alla successiva analisi TLC o MS. Il campione può essere conservato a meno 20 gradi Celsius fino alla successiva analisi.

Una volta preparato il campione, mescolare 200 microlitri di metanolo di grado HPLC con 200 microlitri di cloroformio di grado HPLC in una piccola fiala di vetro vuota, trasferire 200 microlitri della miscela di solvente cloroformio metanolo nella fiala con il lipide A e sonicare il contenuto della fiala per cinque minuti o fino a quando tutto il materiale non si è sciolto. Quindi impostare lo spettrometro di massa per gli elettro in modalità negativa. Ionizzazione spray: riempire una siringa da 250 microlitri con una soluzione di lipidi a.

Inserire la siringa in una pompa a siringa e infondere direttamente il lipide diluito. Un campione a una velocità di flusso compresa tra 2,0 e 3,5 microlitri al minuto. Ottimizza e migliora il segnale degli ioni lipidici regolando l'ottica degli ioni.

Raccogli lo spettro di massa del lipide. Una specie isola e attiva il lipide bersaglio A selezionando CID come metodo MSM. Quindi, aumentare la tensione CID o l'energia di collisione normalizzata fino al lipide precursore.

Una specie ha circa il 10% di abbondanza relativa rispetto al più alto prodotto di ioni acquisiti e media gli spettri fino a quando non viene raggiunto un segnale sufficiente per il rumore. Per gli ioni prodotto, preparare il campione e lo spettrometro di massa come descritto nella sezione precedente. Accendere il laser interfacciato allo spettrometro di massa.

Vedere il protocollo di testo per i dettagli MS Impostare il software dello strumento in modo che il laser attivi il laser ad eccimeri quando gli ioni entrano nella cella HCD dopo questo accendere il generatore di impulsi in modo che il laser venga pulsato ogni due millisecondi. Isolare il lipide, uno ione precursore, selezionando HCD come metodo MS MS e regolare l'energia di collisione all'1%, l'energia di collisione normalizzata attiva lo ione lipidico isolato aumentando l'energia laser e regolando il numero di impulsi laser, che in genere è di dieci impulsi da sei millijoule. Infine, acquisire e calcolare la media degli spettri fino a raggiungere un segnale sufficiente per il rumore.

Per gli ioni del prodotto UVPD. Lo spettro di massa dello ione negativo MALDI TOF del lipide A del ceppo W 3 110 di E Coli K 12 produce la singola specie deprotonata a un rapporto massa/carica di 1796,2 come la principale specie osservata. I dettagli di maldi per l'analisi sono discussi all'interno del protocollo di testo.

In alternativa, lo stesso campione lipidico sottoposto a ESI in modalità negativa produce prevalentemente ioni lipidici deprotonati doppi con un rapporto di carica principale di 898,1 ly sono osservabili ioni lipidici deprotonati con un rapporto di carica principale di 1796,20 ma di abbondanza relativa inferiore alla frammentazione di specie doppiamente deprotonate mediante CID o 193 nanometri. L'UVPD è stato eseguito sul singolo ione lipidico deprotonato. Queste tecniche possono essere utilizzate per assegnare meglio le strutture chimiche, in particolare dei lipidi.

Una specie contenente combinazioni complesse di modificazioni o modificazioni chimiche precedentemente non caratterizzate. I profili di frammentazione sono mostrati con linee tratteggiate che rappresentano i siti di scissione e sono abbinati ai valori del rapporto di carica principale sotto ciascuna struttura fornita. I valori del rapporto di carica principale e i siti di scissione evidenziati in rosso rappresentano ioni prodotto unici associati al lipide marcato con UVPD 32 P.

Un isolato da due diversi ceppi di e coli K 12 è stato analizzato mediante TLC. Il protocollo per questa procedura è dettagliato all'interno del protocollo di testo. Il ceppo K 12 W 3 110 contiene principalmente BIS e tris lipidi fosforilati A o è un pattern TLC più complesso si osserva con 32 p lipide.

Un ceppo isolato da e coli, WD 1 0 1. WD 1 0 1 produce lipidi. Un pesantemente modificato con rabino e fosfoetanolammina.

Poiché sia uno che quattro fosfati primari sono disponibili per la modifica, il lipide A da WD 1 0 1 può essere descritto come singolarmente modificato contenente solo un el amminoarabinosio o fosfoetanolammina a fosfato o doppiamente modificato dove entrambi i fosfati sono modificati in modo combinatorio. Oltre alla modifica a uno e quattro fosfati primari, si osserva anche l'edizione palmitato e aumenta il valore RF della specie lipidica a in questo sistema solvente. Questo protocollo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microbiologia per esplorare ulteriormente le relazioni struttura-funzione rispetto al modo in cui le modifiche lipidiche influiscono sulla biologia dei batteri gram-negativi.

Siamo anche molto interessati e abbiamo dimostrato il potere della SM basata su UVPD per caratterizzare le strutture di molecole biologicamente importanti, come le proteine dei glicani, gli acidi nucleici e altri lipidi complessi. Non dimenticare che lavorare con solventi organici, materiali biologicamente pericolosi e laser può essere estremamente pericoloso. È importante sottolineare che i solventi devono essere maneggiati in cappe chimiche ventilate.

È necessario indossare sempre dispositivi di protezione adeguati come guanti e occhiali protettivi e il laser utilizzato per l'UVPD deve essere adeguatamente schermato.