Coltura e manutenzione Clostridium difficile In un ambiente anaerobico

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare il C difficile dai campioni fecali per la coltura di C difficile per la preparazione di stock di glicerolo per la conservazione a lungo termine e per preparare ed enumerare gli stock di spore per una varietà di applicazioni a valle. Ciò si ottiene isolando prima il C difficile dai campioni di feci mediante piastratura su terreno selettivo. Il secondo passo consiste nel coltivare C difficile in terreno liquido e mantenere le scorte a lungo termine di C difficile in glicerolo.

Successivamente, il C difficile viene recuperato da ceppi di glicerolo congelati e striato su piastre di agar. Nella fase finale, gli stock di spore di C difficile vengono preparati ed enumerati seguendo questi protocolli. Il C difficile può essere coltivato su vari terreni per verificarne e confermarne l'identità ed essere coltivato e mantenuto con successo.

Questi steli e colture di glicerolo possono essere ulteriormente utilizzati in numerose applicazioni a valle, tra cui studi sugli animali e ulteriori studi di biologia molecolare. Il vantaggio principale dell'utilizzo di una camera anaerobica in vinile per coltivare il c difficile rispetto ad altri metodi come l'uso di barattoli di candele, è che è possibile mantenere un ambiente anaerobico rigoroso, consentendo una crescita costante e affidabile del c difficile. In generale, le persone che sono nuove a queste tecniche possono incontrare problemi a causa della mancanza di destrezza all'interno della camera a causa dei guanti, e anche a causa della necessità critica di pianificare i loro esperimenti in anticipo.

A dimostrare queste procedure sarà un tecnico del mio laboratorio, Jose Suarez All'inizio. Questa procedura può essere eseguita in condizioni aerobiche. Per prima cosa, pesa il campione di feci.

Questo è necessario per enumerare il c difficile dalle feci. Quindi risospendere il campione di feci in un XPBS e vorticare per assicurarsi che il campione di feci sia completamente risospeso. Successivamente, effettuare la diluizione seriale del campione di feci risospese in un XPBS per un isolamento appropriato o l'enumerazione delle unità formanti colonie o del pergramma CFU delle feci da qui in poi.

Eseguire la procedura in condizioni anaerobiche per garantire che le cellule vegetative di C difficile non siano esposte all'ossigeno. La camera anaerobica utilizzata in questo esperimento è mantenuta a 37 gradi Celsius. Utilizzando la tecnica asettica.

Applicare 100 microlitri di ogni diluizione seriale alle piastre Toro collate oxetane, cyclo Seine, agar fruttosio o T-C-C-F-A. Queste piastre sono state predate per almeno una o due ore nella camera anaerobica per garantire la rimozione dell'ossigeno residuo. Per isolare le colonie per un'enumerazione accurata o per altre applicazioni a valle.

Utilizzare un anello di inoculazione sterile per distribuire uniformemente la coltura applicata sulla superficie della piastra T-C-C-F-A. Incubare le piastre in modo anaerobico per 48 ore a 37 gradi Celsius 48 ore dopo. Identificare le colonie di c difficile in base al loro aspetto piatto e irregolare a vetro smerigliato per garantire che il c difficile vegetativo non venga ucciso dall'esposizione all'ossigeno.

Le piastre per l'isolamento delle colonie per le applicazioni a valle devono essere sempre conservate all'interno della camera anaerobica. Per l'enumerazione delle colonie, le piastre possono essere portate all'esterno della camera anaerobica. Si noti che una volta che una piastra viene portata fuori dalla camera, il c difficile vegetativo sarà esposto all'ossigeno e morirà.

Queste colonie di C difficile non possono essere salvate anche se la piastra viene rimessa nella camera. Contare le colonie di C difficile di ogni diluizione e calcolare il numero di CFU per grammo di campione di feci da coltivare e produrre gambi di glicerolo di c difficile. Utilizzare un anello di inoculazione sterile per prelevare una singola colonia e passare a un'infusione cardiaca cerebrale pre-ridotta.

Integrato con estratto di lievito o piastra di agar BHIS, integrato con singole colonie e quadranti di striscia di cisteina allo 0,03% utilizzando un nuovo anello di inoculazione sterile per ciascun quadrante. Incubare le piastre in modo anaerobico a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Una volta che le colonie isolate compaiono sulle piastre di agar BHIS, scegliere una singola colonia isolata e sospendere la colonia in 10 millilitri di terreno liquido BHIS preridotto, integrato con cisteina allo 0,03% di L incubato durante la notte.

Anaerobicamente a 37 gradi Celsius o fino a quando la coltura non diventa torbida. Il giorno seguente a 333 microlitri di glicerolo al 50% e 666 microlitri di coltura c difficile in una provetta criogenica da 1,8 millilitri. Per creare uno stock di glicerolo al 15% del ceppo isolato, tappare ermeticamente la provetta criogenica e mescolare.

Bene, rimuovere immediatamente il brodo dalla camera anaerobica e metterlo in un congelatore a 80 gradi Celsius negativi per la conservazione a lungo termine. Per iniziare questa procedura, rimuovere il brodo di glicerolo congelato di c difficile dal congelatore a 80 gradi Celsius negativi. Per evitare lo scongelamento.

Mettere immediatamente il brodo di glicerolo congelato in una griglia di raffreddamento che è stata conservata a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius prima dell'uso. Portare il brodo di glicerolo congelato nel rack di raffreddamento nella camera anaerobica utilizzando una tecnica asettica e un ciclo di inoculazione sterile. Posizionare una piccola quantità di brodo sulla piastra e strisciare su un quadrante della piastra.

Ruotare la piastra di 90 gradi e utilizzare una nuova striscia di ansa di inoculazione sterile sul secondo quadrante. Ripetere per il terzo e il quarto quadrante per garantire l'isolamento delle singole colonie. Rimuovere immediatamente il brodo di glicerolo congelato dalla camera anaerobica e rimetterlo nel congelatore a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Incubare la piastra in modo anaerobico durante la notte a 37 gradi Celsius per purificare le spore dalla coltura di c difficile. Ceppi da stock di glicerolo congelato su piastre BHIS preridotte. Seguendo la procedura illustrata nel segmento precedente.

Incubare anaerobicamente per una notte a 37 gradi Celsius il giorno successivo. Rere singole colonie in diverse prede ridotte 70 30 piastre. Incubare anaerobicamente a 37 gradi Celsius per 24-48 ore.

Una volta formate le spore, rimuovere le piastre dalla camera anaerobica. Raschiare le piastre utilizzando un anello di inoculazione sterile e risospendere le cellule in 10 millilitri di XPBS sterile. Scartare le piastre, pellettare le celle a 3000 G per 15 minuti.

Rimuovere il surnatante, aggiungere un millilitro di un resus XPBS, sospendere e pellettare di nuovo in questo modo. Lavare le cellule due volte in PBS, incubare a quattro gradi Celsius durante la notte per favorire la lisi delle cellule vegetative e madri il giorno successivo, incubare a 70 gradi Celsius per 20 minuti per uccidere eventuali cellule vegetative residue. Per determinare le CFU per millilitro, diluire in serie ogni preparazione di spore in un XPBS e placcare su BHIS preridotto più piastre di incubazione con collazione Toro di sodio allo 0,1% a 37 gradi Celsius per un minimo di 24 ore prima di enumerare le colonie.

Le spore possono essere conservate in un XPBS in entrambe le stanze, a temperatura per la conservazione a breve termine o a quattro gradi Celsius per la conservazione a lungo termine. A.Un esempio di c difficile coltivato su pecore anaerobiche BHIS e Columbia. I terreni di agar sanguigno possono essere visti qui.

Il C difficile forma colonie irregolari che sono piatte e possiedono un aspetto a vetro smerigliato che è evidente su entrambi i mezzi. Il pannello A mostra un clinico sensibile all'eritromicina è isolato c difficile 630 E coltivato su agar BHIS, un terreno arricchito non selettivo per 24 ore. A 37 gradi Celsius, le colonie di pecore anaerobiche Columbia mostrate nel pannello B appaiono simili a quelle coltivate su BHIS sotto luce bianca.

Tuttavia, l'uso di questo mezzo prevede anche la rilevazione della fluorescenza verdastra o agrumata esibita dal C difficile sotto la luce ultravioletta a onde lunghe mostrata nel pannello C Seguendo questa procedura. Altri metodi come le curve di crescita in mezzo liquido, DNA e RNA, colonia di isolamento, PCR e altre tecniche di biologia molecolare e manipolazione adatte per il c difficile, nonché l'utilizzo di spore di c difficile per studi sugli animali possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande di biologia molecolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare la coltura e mantenere le cellule vegetative e le spore c difficile all'interno di un ambiente anaerobico.

Non dimenticare che il c difficile è un agente patogeno umano e animale che può causare malattie gastrointestinali. Gli esperimenti con c difficile devono essere eseguiti in condizioni di livello di biosicurezza 2 appropriate.